Verilen Bir Numunede Bulunan Farklı Bakterileri İzolasyon Etme ve Saf Kültürlerini Koruma Amaçları

Belirli bir örnekte bulunan farklı bakterileri izole etmeyi ve saf kültürlerini korumayı hedefleyin.

Amaç:

Doğada bulunan bakteriler ayrılmış türler olarak ortaya çıkmaz, aksine farklı türlerin karışık popülasyonları olarak ortaya çıkarlar.

Bu nedenle, tek tek bakteri türlerini incelemek için önce onları karışık popülasyondan ayırmak gerekir. Bu işleme 'bakteri izolasyonu' denir.

Katı bir besiyerinin yüzeyindeki karışık bakteri popülasyonunun ayrı koloniler halinde büyütülmesi ile gerçekleştirilir. 'Koloniler', her biri tek bir bakterinin çoğalmasını temsil eden, katı ortamın yüzeyinde yetişen bireysel, makroskopik olarak görülebilen bakteri kütleleridir.

Her bir koloni, tek bir bakterinin çoğalmasından ve çoğalmasından geldiğinden, kolonide bulunan tüm bakteriler aynı türe aittir. Böylece, her koloni tek bir bakteri türünün çok büyük bir popülasyonunu temsil eder.

Bu koloniler, besinsel agar slantlarını ayırmak için aseptik olarak transfer edilir ve orada büyümelerine izin verilir. Agar meyilli üzerinde ayrı ayrı yetiştirilen izole edilmiş bakteri türlerine 'saf kültürler' denir. Her 15 ila 30 günde bir taze meyvelere aktarılır, böylece aşırı kalabalıklık, besin eksikliği ve metabolit birikimi nedeniyle orijinal özelliklerini kaybetmezler.

Böylece saf bakteri kültürleri düzenli aralıklarla taze meyvelere tekrar tekrar transfer edilerek laboratuvarda tutulur. Bu süreç “saf kültürün korunması” olarak bilinir. Saf kültürler, laboratuarda daha sonra tanımlanmaları için çeşitli boyama, biyokimyasal, serolojik ve moleküler tekniklerle ve gelecekteki kullanımlarıyla korunurlar.

'Stok kültürleri', cins, tür, alt tür, tür veya alt tür seviyesine göre uluslararası olarak tanımlanmış standart saf kültürlerdir. Uluslararası kabul görmüş mikrobiyoloji laboratuvarlarında tutulurlar.

Diğer laboratuvarlar bunları bu laboratuvarlardan alabilir ve düzenli aralıklarla taze meyvelere tekrar tekrar transfer ederek stok laboratuvarları olarak kendi laboratuvarlarında saklayabilir. Bu laboratuvarlarda elde edilen saf kültürlerin özelliklerini standart stok kültürleriyle karşılaştırmak suretiyle doğrulanmış tanımlama için kullanılırlar.

Prensip:

Belirli bir materyaldeki (katı, sıvı veya yüzey) mevcut bakteri popülasyonu, daha önce 'Bakterilerin Yetiştirilmesi' altında tarif edildiği gibi yayılmış plaka veya çizgi plaka yöntemi ile besin agar plakaları üzerinde büyütülür. Bir agar plakasında bulunan her izole edilmiş koloni, her bir koloni tek bir bakteriden büyüdüğü için bir bakteri türünden oluşur.

Böylece, bakteriler agar plakaları üzerinde iki teknikle izole edilir:

(a) Yayılmış plaka tekniği

(b) Çizgi plaka tekniği

Temsilci koloniler (farklı özelliklere sahip koloniler) seçilir ve saf kültürleri elde etmek için agar eğrilerini ayırmak için aseptik olarak aşılanır. Her 15 ila 30 gün sonra, bu saf kültürlerin bakımı için taze meyvelere aktarılırlar.

Gerekli malzemeler:

Test tüpleri (5 no.), 250 ml konik şişesi (1 no), 0.1 N NaOH, 0.1 N HCI, damıtılmış su, besin agarı, emici olmayan pamuk, ilmik, kraft kağıt, iplik (veya lastik bant), pH kağıdı (veya pH metre), bunsen brülörü, otoklav, laminer akış odası, inkübatör, izole edilmiş bakteri kolonileri içeren plakalar (yayılmış plaka veya çizgi plaka).

Prosedür:

1. Besleyici agar besiyerinin içerikleri veya 100 ml besiyeri için gereken hazır tozu tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 250 ml'lik bir konik şişede 100 ml damıtılmış su içinde çözülür (Şekil 6.4).

2. pH değeri, bir pH kağıdı veya pH metre kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HC1 veya daha az ise 0.1 N NaOH kullanılarak 7.0'a ayarlanır.

3. Şişe, agarı ortam içinde tamamen çözmek için ısıtılır.

4. Katılaşmadan önce, sıcak erimiş haldeki ortam 5 test tüpüne (her biri yaklaşık 20 mi) dağıtılır.

5. Test tüpleri koton tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

6. Bir otoklavda 121 ° C'de (15 psi basınç) 15 dakika sterilize edilirler.

7. Sterilizasyondan sonra, otoklavdan çıkarılır ve besiyerini soğutmak ve katılaştırmak için eğik pozisyonda tutulur. Eğiklik durumunda katılaşmış besin agar ortamı içeren bu test tüplerine 'besin agar eğrisi' denir.

8. Adım 10 ve 11, tercihen laminer bir akış odasında aseptik bir teknik izlenerek gerçekleştirilmelidir. Sterilize ortam veya kültür içeren kapların ağzı, pamuk tıkacı çıkarıldıktan ve geri koymadan önce bunsen yakıcının alevi üzerinde gösterilmelidir.

Kullanımdan önce ilmekler, kırmızı sıcaklığa ısıtıp ardından oda sıcaklığına soğutmak için 30 saniye soğutularak alev üzerinde sterilize edilmelidir. Asla çok sıcak olduklarında kullanılmamalıdırlar, çünkü mikropları onlara dokunduğunda öldürürler.

9. Önceki deneyde, yayılma plakasında veya çizgi plakasında izole edilmiş koloni gözlemlenebilirse, farklı özelliklere sahip beş koloni temsili koloniler olarak seçilmiştir.

10. Bir ilmek alev üzerine sterilize edilir ve temsili kolonilerin her birinden bir bakteri iltihabı aseptik olarak alınır. Döngü ağar çekicisine sokulur, böylece bakteri döngüsü çekik ucuna gider. Döngü, dalgalı bir çizginin oluşması için eğik yüzeyine temas eden dalgalı bir şekilde dışarı doğru hareket eder.

11. Halka alev sterilize edilir ve benzer şekilde dört temsili koloninin geri kalanı ayrı ayrı solda dört eğimli olarak inoküle edilir. Her aşılamadan sonra döngü sterilize edilir.

12. Beş aşılanmış meyil bir inkübatörde 24 saat 37 ° C'de inkübe edilir.

Gözlemler (Kültürel Özellikler):

(i) Gözlemlenen Boyu Boyunca Büyüyen Dalgalı Bir Çizgi:

Büyüme gerçekleşti.

Eğik eğim özellikleri için eğiklik aşağıdaki gibi gözlenir (Şekil 6.5).

1. Büyüme Bolluğu:

Büyüme miktarı hiçbiri, hafif, orta veya büyük olarak tanımlanır.

2. Pigmentasyon:

Kromojenik mikroorganizmalar, yüzey kolonilerinde görüldüğü gibi organizmanın renklendirilmesinden sorumlu olan hücre içi pigmentler üretebilir. Diğer organizmalar, ortama atılan hücre dışı çözülebilir pigmentleri üretir ve ayrıca bir renk üretir. Bununla birlikte, çoğu organizma kromomerik değildir ve beyazdan gri görünecektir.

3. Optik Özellikler:

Optik özellikler, büyüme boyunca iletilen ışık miktarı temelinde değerlendirilebilir.

Bu özellikler şöyle tanımlanmaktadır:

(A) Opak: Işık iletimi yok.

(B) Yarı saydam: Kısmi ışık iletimi.

(C) Şeffaf: Tam ışık iletimi.

4. Form:

Tek sıralı büyüme çizgisinin agar yüzeyi üzerindeki görünümü aşağıdaki şekilde belirtilmiştir:

(A) Filiform: Düzgün kenarlı, kesintisiz iplik benzeri büyüme.

(B) Echinulate: Düzensiz kenarlı kesintisiz, iplik benzeri büyüme.

(C) Boncuklu: Yarı birleştiğinde kolonilerle birleştiğinde değil.

(D) Yaygın: İnce, yayılan büyüme.

(E) Arborescent: Ağaç benzeri büyüme.

(f) Rhizoid: Kök benzeri büyüme.

(ii) Aşılama Hattı Boyunca Büyüme Yok:

Hatalı aşılama tekniği, Aşılama tekrarlanır. C Bakterilerin Sayımı.

C. Bakterilerin sayımı:

Belirli bir örnekteki belirli bir koşulda bakteri aktivitesinin kapsamı, esasen, türlerine bakılmaksızın içinde bulunan toplam bakteri sayısına bağlıdır. Bu nedenle, mikrobiyolojik analizleri sırasında gıda, su, toprak, hava ve doku örneklerinde bulunan toplam bakteri sayısını bulmak çok sık gerekli olmaktadır.

Belirli bir örnekteki bakteri sayısının tahmininde 'bakteri sayımı' denir. Aşağıda verilen bakterilerin numaralandırılması için çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemlerin hepsinin homojen bir süspansiyonda bulunması için bakteri ihtiyacı vardır.

Bu nedenle sıvı numunelerin homojen bakteri süspansiyonları olduğu varsayılır ve doğrudan kullanılır, katı numuneler ise bakteri homojen süspansiyonları elde etmek için steril tuzlu su çözeltilerinde homojenleştirilir.

Yaygın olarak kullanılmaz:

(I) Doğrudan Yöntemler:

(a) Doğrudan mikroskobik sayım

(b) Elektronik hücre sayacı

(II) Dolaylı Yöntemler:

(c) Kimyasal yöntemler

(D) Türbidimetrik yöntem

(E) Membran filtre sayısı

En yaygın olarak kullanılan:

(f) Seri seyreltme-agar kaplama yöntemi veya Toplam Plaka Sayma Yöntemi (TPC yöntemi)

(a) Doğrudan Mikroskobik Sayım:

Bu yöntemde, homojen bakteri süspansiyonunun bir bölümündeki bakterilerin sayısı doğrudan bir mikroskop altında sayılır ve numunedeki toplam bakteri sayısı matematiksel olarak belirlenir.

Bu yöntemin avantajı, çok hızlı olmasıdır. Dezavantajları, yaşayan (yaşayabilir) ve ölü hücrelerin sayılması ve yöntemin mililitre başına bir milyondan az bakteri popülasyonuna duyarlı olmamasıdır.

Sayım aşağıdaki gibi iki yöntemle yapılabilir:

(i) Petroff-Hauser Odası:

Homojen bakteri süspansiyonunun bir bölümünün doğrudan mikroskop altında sayılması için yerleştirildiği özel bir sayma odasıdır.

(ii) Breed Smear:

Bakteriler, slayt üzerinde 1 mm2'lik bir alana sınırlanmış lekeli lekeler kullanılarak doğrudan mikroskop altında sayılır. Esas olarak sütte bakteri sayımı için kullanılır.

(b) Elektronik Hücre Sayacı:

'Coulter counter' gibi bir elektronik hücre sayacı, bakteri hücrelerinin sayısını doğrudan saymak için kullanılır. İletken bir akışkanda hazırlanan homojen bir bakteri hücresi süspansiyonu, içinden bir elektrik akımının aktığı bir dakika açıklığından geçmesine izin verilir.

Açıklıktaki direnç elektronik olarak kaydedilir. Bir hücre delikten geçtiğinde, iletken olmadığında, direnci anlık olarak arttırır. Direncin anlık olarak artma sayısı, süspansiyonda bulunan bakteri sayısını gösteren elektronik olarak kaydedilir.

Bu yöntemin avantajı, son derece hızlı olmasıdır. Dezavantajları hem yaşayan (yaşayabilir) hem de ölü hücrelerin sayılması ve cihazın bakteri hücreleri ile atıl partikül madde arasında ayrım yapamamasıdır.

(c) Kimyasal Yöntemler:

Bu yöntemler bakteri popülasyonundaki artışla birlikte artan kimyasallar başta olmak üzere kimyasal maddelerin miktarını tahmin eder.

Tahmini ana parametreler aşağıdaki gibidir:

(i) Protein konsantrasyonu

(ii) DNA konsantrasyonu

(iii) Kuru ağırlık

(iv) Karbondioksit üretimi

(v) Oksijen alımı

(vi) Laktik asit üretimi

(d) Türbidimetrik Yöntem:

Bakteriler sıvı besin bakımından zengin ortamlarda (örn. Besin suyu) yetiştirildiğinde, bolca büyümeleri bakteri hücrelerinin içinde çoğunlukla asılı kaldığı için ortamları bulanıklaştırır. Bulanıklık, ortamdaki hücre sayısındaki artışla artar. Bulanıklık arttıkça, ortamın 'absorbansı' veya 'optik yoğunluğu (OD)' artar.

Ortamdaki bakteri hücrelerinin süspansiyonunun OD'si, 600 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Süspansiyondaki bakteri hücrelerinin sayısı, OD'nin bilinen farklı bakteri konsantrasyonları için OD değerleri çizilerek hazırlanan standart bir eğri ile karşılaştırılmasıyla tespit edilir. Yöntem hızlıdır ancak 10 milyondan fazla hücrenin bakteri süspansiyonu ile sınırlıdır.

(e) Membran Filtre Sayısı:

Bu yöntem, bir sıvı numunedeki bakteri sayısı çok az olduğunda kullanılır. Bakteri konsantrasyonunu arttırmak için önce sıvı numunesi steril bir membran filtre kullanılarak sterilize edilmiş bir membran filtre aparatından aseptik olarak süzülür.

Kapana kısılmış bakterileri içeren zar filtresi aseptik olarak seçici bir diferansiyel sıvı ortam ile doyurulmuş emici bir ped içeren steril bir petri kabına aktarılır. Ortam, filtrenin yüzeyine geçer. Kuluçkadan sonra, filtre üzerinde oluşan koloni sayısı basit bir mikroskop kullanılarak sayılır.

(f) Seri Seyreltme-Agar Kaplama Yöntemi veya TPC Yöntemi:

Bakterilerin sayımı için çok yönlü ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.