Seri Seyreltme Agar Kaplama Yöntemi veya Toplam Plaka Sayımı (TPC) Yöntemi ile Numune İçinde Bulunan Bakteriler

Toplam Plaka Sayısı (TPC):

Bir numunede bulunan bakterileri seri dilüsyonlu agar kaplama metodu veya toplam plaka sayısı (TPC) metodu ile numaralandırmak.

Amaç:

Belirli bir örnekteki belirli bir koşulda bakteri aktivitesinin kapsamı, esasen, türlerine bakılmaksızın içinde bulunan toplam bakteri sayısına bağlıdır.

Bu nedenle, mikrobiyolojik analizleri sırasında gıda, su, toprak, hava ve doku örneklerinde bulunan toplam bakteri sayısını bulmak çok sık gerekli olmaktadır. Bu toplam bakteri sayısı hem yaşayan hem de ölü bakterileri içerir. ' Ölü bakteri üremez ve üremez.

Büyüyen ve çoğalabilen spesifik bakteriyel aktivite ile sonuçlanan sadece canlı bakterilerdir (canlı bakteriler). Bu nedenle, farklı örneklerde canlı bakteri hücrelerini saymak çok sıklıkla gereklidir. Bununla birlikte, direkt mikroskopik sayım, elektronik hücre sayımı, kimyasal yöntemler ve spektrofotometrik yöntem gibi sayma yöntemlerinin çoğu hem ölü hem de yaşayan hücreleri saymaktadır.

Bu yöntemler yaşayan ve ölü hücreler arasında ayrım yapamazlar. Bu nedenle, sadece canlı bakteri hücrelerini numaralandıran seri seyreltme-agar kaplama yöntemi, farklı numunelerdeki canlı canlı hücreleri saymak için evrensel olarak kullanılan bir yöntemdir.

Prensip:

Kesin bir katı numune ağırlığı, homojen bir bakteri süspansiyonu elde etmek için dokuz hacim steril salin içinde aseptik olarak homojenleştirilir. Sıvı numune doğrudan homojen bakteri süspansiyonu olarak kullanılır. Bu şekilde elde edilen bakterilerin süspansiyonları seri olarak seyreltilir (10 kez, 100 kez, 1000 kez vb.). Burada 10 -1, 10 -2, 10 -3 vs. dilüsyonlar olarak adlandırılır.

Karşılıklı karşılıklarına (10 1, 10 2, 10 3 vs.) seyreltme faktörleri denir. Her dilüsyondan bakteri süspansiyonunun belirli bir hacmi agar plakaları üzerine aşılanır ve ayrı ayrı bakteri hücrelerini birbirinden ayırmak ve birbirlerinden izole etmek için düzgün şekilde yayılır.

Bakterilerin sayımı için aşılanması, aşağıdaki iki teknikle yapılır:

1. dökün plaka tekniği

2. Yayılmış plaka tekniği

1. Plak Levha Tekniği:

Bu teknikte, 1 ml bakteri süspansiyonu steril bir petri kabına bırakılır ve daha sonra sıvılaştırılmış besin agar ortamı üzerine dökülür. Petri kabı, süspansiyonun ortam ile düzgün bir şekilde karışmasını sağlamak için hafifçe döndürülür. Soğumaya ve katılaşmaya bırakılır.

2. Yayılmış Plaka Tekniği:

Bu teknikte, 0.1 ml bakteri süspansiyonu hazırlanan bir agar plakaya düşürülür. Daha sonra, süspansiyon damlası, agar plakasına steril bir cam serpme makinesi ile düzgün bir şekilde yayılır.

Hatayı en aza indirmek için, seyreltilmiş her süspansiyon 2-5 kopya plaka üzerine kaplanır. Aşılanan plakalar, 37 ° C'de 24 saat süreyle inkübe edilir. Bu süre boyunca, agar plakasındaki izole edilmiş her bir bakteri hücresi, bir 'koloni' adı verilen makroskopik bir görünür bakteri hücresi kütlesi üretmek üzere hızla büyür ve çoğalır. Bu nedenle, plakadaki koloni sayısı, numunedeki bakteri sayısını temsil eder.

Bununla birlikte, sıklıkla, yayılma sırasında, bazı hücreler düzgün bir şekilde ayrılmayabilir ve bu gibi ayrılmamış birkaç hücre, tek bir koloniye yol açabilir. Ayrıca, az sayıda hücre çiftler, zincirler veya kümeler halinde kalma eğilimindedir.

Burada her çift, zincir veya küme bir koloni üretir. Bu nedenle, her bir koloni kesin anlamda tek bir bakteri temsil etmemektedir. Bu nedenle bakteri sayımını 'Hayır' olarak ifade etmek yerine. Bakterilerin / gram veya örneğin numunenin ml 'si, genellikle, gram veya ml başına (CFU / gm veya ml) koloni oluşturan birim sayısı olarak ifade edilir.

Orijinal numunedeki toplam plaka sayısı (TPC), CPU sayısı ilgili dilüsyon faktörleriyle çarpılarak hesaplanır. Orijinal örnekteki bakteri sayısını hesaplarken 'numaralandırma kuralları' takip edilir.

Gerekli malzemeler:

Petri kapları (15 no.), 2 ml pipetler (10 no.), 10 ml pipet (1 no.), Test tüpleri (10 no.), Konik şişeler (her biri 500 ml ve 1 litre - 1 no.) 500 ml'lik beher kabı (2 adet), cam serpme makinası, paslanmaz çelik pipet kasası, kraft kağıt, iplik (veya lastik bant), emici olmayan pamuk, etil alkol, sodyum klorür (NaCl), 0.1N hidroklorik asit (HCI), 0.1 N sodyum hidroksit (NaOH), distile su, besin agarı, sıvı numune (örn. Havuz suyu / atık su), katı numune (örn. Toprak / balık eti / istiridye eti / işlenmiş gıda), pH belgesi (veya pH metre), havaneli ve harç (veya homojenleştirici), bunsen brülörü, sıcak hava fırını, otoklav, inkübatör, laminer akış odası, Quebec koloni sayacı.

Prosedür:

1. On pipet (paslanmaz çelik pipet kasasında), 15 petri kabı ve bir çift havaneli ve harç (veya bir homojenleştirici kabı) sıcak hava fırınında 180 ° C'de 3 saat sterilize edilir. Alternatif olarak, bunlar kraft kağıdı ile kaplanabilir, iplik veya lastik bant ile bağlanabilir ve ortam ile birlikte otoklavda sterilize edilebilir (Şekil 6.6).

Petri kabı sayısı ve buna göre kullanılacak ortamın miktarı, gerekli olan çoğaltma ve dilüsyon sayısına bağlı olarak hesaplanır. Burada, cam eşyalar ve ortam, tekli çoğaltma ve 10 ila 6'ya kadar seyreltme için alınmıştır. Sterilizasyon uzun bir süreç olduğundan, cam eşyaların sayısı ve sterilizasyon için alınan ortamın miktarı herhangi bir olası hatanın önüne geçmek için biraz daha fazladır.

2. 4.25 g NaCl, fizyolojik salin (% 0.85) elde etmek için 500 ml damıtılmış su içinde eritilir. Bu salin çözeltisinden 225 ml, 500 ml'lik bir konik şişeye dökülür. Ağzı koton tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlı. Katı numuneyi seyreltmek için ilk seyrelticiler olarak kullanılır.

3. Kalan tuzlu su üzerinde 9.0 ml de 10 test tüpünün her birine pipetlenir. Ağızları pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlı. Bunlar seri seyreltme için seyrelticiler olarak kullanılır.

4. Besleyici agar besiyerinin içerikleri veya 500 ml besiyeri için gereken hazır toz tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 1 litre konik bir şişede 500 ml damıtılmış su içinde çözülür.

PH değeri, bir pH kağıdı veya pH ölçer kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HC1 kullanılarak 7.0'a veya daha azsa 0.1N NaOH kullanılarak 7.0'a ayarlanır. Şişe, agarı besiyerinde tamamen çözmek için ısıtılır. Daha sonra, pamuk tıkanmış, kraft kağıt ile kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

5. 225 ml salin içeren 500 ml konik şişesi, her biri 9 ml salin içeren 10 test tüpü ve 500 ml besin agar ortamı içeren 1 litre konik şişesi, 15 dakika boyunca 121 ° C'de (15 psi basınç) sterilize edilir. otoklavda.

6. Sterilizasyondan sonra, sterilize edilmiş malzemeler otoklavdan çıkarılır ve ortamın katılaşmasına izin vermeden bir süre soğumaya bırakılır. Ortamın soğutulması plakaların içinde su damlacıklarının yoğunlaşmasını ve birikmesini önler. Ortam, depolama sırasında önceden hazırlanmış ve katılaşmışsa, tamamen eriyene kadar dikkatlice ısıtılarak sıvılaştırılmalıdır.

7. Sterilize besleyici agar besiyeri soğumadan ve katılaşmadan önce, sıcak erimiş halde agar plakaları hazırlamak için, eritilmiş besiyerinin petri tabanını kaplaması için 6 sterilize edilmiş petri kabına (her biri yaklaşık 20 ml) aseptik olarak dökülür. tamamen bulaşık.

Sonra, plakalar kapaklarıyla kapatılır ve içindeki ortamı katılaştırmak için soğumaya bırakılır. Plakaların ve kapakların iç yüzeyinde yoğunlaşabilen su buharı, plakaları ve kapaklarını bir inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık 1 saat süreyle ters konumda tutularak buharlaştırılır.

8. 25 g katı numune (örn. Balık eti / istiridye eti / işlenmiş gıda) ağırlıktadır ve aseptik olarak 225 ml sterilize edilmiş salin (seyreltici) içinde homojenleştirilmiştir (Şekil 6.7). Bu, 10 kez dilüsyon verir (dilüsyon = 10-1 ). Sıvı numune için 1 ml numune aseptik olarak 9 ml sterilize edilmiş salin tüpüne pipetlenir. Bu aynı zamanda 10 kez dilüsyon verir (dilüsyon = 10-1 ).

9. 10 1 seyreltmeden 1 ml, başka bir test tüpünde 9 ml steril tuzlu suya aktarılır. Bu, 100 kez seyreltme verir (seyreltme = 10-2 ). 10-2 seyreltmeden 1 ml sterilize edilmiş bir petri kabına ve 0.1 ml aynı pipetten bir agar plakaya damlatılır. Her dilüsyon için ayrı bir sterilize pipet kullanılır. Kullandıktan sonra atma kavanozuna batırılır.

10. 10-2 dilüsyonun 1 ml'si başka bir test tüpünde 9 ml sterilize edilmiş saline transfer edilir. Bu 1000 kat dilüsyon verir (dilüsyon = 10 -3 ). 10 -3 seyreltmeden 1 ml sterilize edilmiş bir petri kabına ve 0.1 ml aynı pipetten bir agar plakaya damlatılır. Benzer bir şekilde seyreltme, seri olarak 10-6'ya kadar sürdürülür, her seferinde 1 ml steril bir petri kabına ve 0.1 ml aynı pipetten bir agar plakaya aktarılır.

11. Daha sonra, agar plakaları üzerindeki süspansiyon damlaları, steril bir cam serpme makinesi tarafından aseptik olarak yayılır. Her bir plakaya yayıldıktan sonra, alkole batırılarak ve bir alev üzerinden gösterilerek alevle sterilize edilir. Bu 'yayma levha tekniği'.

12. Her biri 1 ml bakteri süspansiyonu içeren petri kapları alınır ve sterilize sıvılaştırılmış besin agarı bunlara dökülür. Süspansiyonun besiyerine düzgün bir şekilde karışmasını sağlamak için hafifçe döndürülürler. Plakalar, ortam katılaşıncaya kadar soğumaya bırakılır. Bu 'dökün plaka tekniği'.

13. Ardından, plakalar ters bir konumda, yukarıdan aşağıya, 37 ° C'de 24 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edilir (Şekil 6.7).

14. Aşılanmayan agar plakası, üzerinde hiçbir büyüme görülmediği gibi uygun sterilizasyonun sağlanması için kontrol olarak inkübe edilir.

Gözlemler:

Plakalardaki bakteri kolonileri doğrudan veya bir Quebec kolonisi sayacı yardımı ile sayılır. Bundan, gram başına mevcut bakteri sayısı veya orijinal numunenin ml'si hesaplanır. Buna numaralandırma denir.

Numaralandırma Kuralları:

1. 30 ila 300 koloni içeren Petri kapları dikkate alınmalıdır.

2. Ortalama kopya ve üçlü sayılar (R1, R2, R3…), yalnızca bir sayı diğerinin iki katından fazla değilse göz önünde bulundurulur. Biri ikiden fazla ise, diğer düşük değer alınır.

3. Dökme plaka tekniği için bakteri sayısı No.X10 c / gm'dir, burada c = seyreltme faktörü. Yayma levha tekniği için, bakteri sayısı No. X10 c + 1 / gm'dir, burada c = seyreltme faktörü. Sayı (x.yz X 10 m ) biçiminde iki ondalık basamağa dönüştürülür. Örneğin, 288 X 106, 2.88 X 106 olarak ifade edilir.

4. Tüm dilüsyonlarda koloni sayısı 300'den fazlaysa, en yüksek dilüsyon için sayılır ve tüm dilüsyonlarda 30'dan az ise, en düşük dilüsyon için sayılır. Her iki durumda da sayım şu şekilde temsil edilir: Dökme plaka tekniği için Tahmini No. X 10 c / gm veya ml ve yayma plakası tekniği için Tahmini No. X 10 c + 1 / gm veya ml.

5. Alınan herhangi bir dilüsyonda koloni gözlenmezse, aşağıdaki şekilde temsil edilir: Tahmini <1 x en düşük dilüsyon.

6. Seri dilüsyon 10 kez gerçekleştiğinden, matematiksel olarak iki dilüsyonun 30 ile 300 arasında koloniye sahip olamayacağı açıktır. Örneğin, 10 -3'ün 50 kolonisi varsa, 10-2'nin 500 olması gerekir (örn. 300) ve 10 -4, 5 (yani <30) koloniye sahip olmalıdır.

Bununla birlikte, bu, bakteriler homojen bir çözelti olarak oluşmadığından gerçekte oluşmaz; seyrelticilerde bir süspansiyon olarak ortaya çıkar. Sayılabilir kolonilere sahip iki dilüsyon varsa (30 ila 300 arasında) ilk önce her dilüsyon kullanarak koloni oluşturan birim / gram veya ml sayısını hesaplayın.

Bir değer diğerinin iki katından fazla ise, düşük değeri bildirin. Değilse, iki değerin ortalamasını alın ve bu değeri bildirin.