Katı, Sıvı ve Sürüntü Örneklerinden Bakteri Yetiştiriciliği (Şekilli)

Amaç:

Bakteri yetiştiriciliğinin temel amaçları şunlardır:

1. Bakterilerin sayısının, koloniler veya süspansiyonlar olarak görünür şekillerde elde edilmesi için arttırılması.

2. Bakterilerin izolasyonu.

3. Saf stok kültürünün ve standart kültürlerin bakımı.

4. Örneklerde bakteri sayımı.

5. Bir örnekte ilgilenilen belirli bakterilerin tespiti ve numaralandırılması.

6. Bakterilerin koloni özelliklerinden, meyvelerdeki büyüme özelliklerinden ve farklı ortamlardaki biyokimyasal aktivitelerden tanımlanması.

Bununla birlikte, bu deneyin amacı, yalnızca koloniler veya süspansiyon olarak görünür şekillerde elde etmek için, sıvı, katı ve yüzey numunelerinden bakteri yetiştirmek ve bunları katı ve sıvı ortamlarda yetiştirmektir.

Prensip:

Bakteriler sterilize edilmiş, besleyici olarak zengin sıvı veya katı ortamlarda kültürlenir. Et suyu adı verilen sıvı ortam, "et suyu tüpleri" oluşturmak üzere test tüplerinde bulunurken, agar ortamı olarak adlandırılan katı ortam "agar plakaları" veya basitçe "plakalar" oluşturmak için petri kaplarında bulunur. Bakterilerin ekimi için bakteri içerdiğinden şüphelenilen bazı malzemelere ihtiyaç vardır.

Gördüğümüz şeylerin çoğu bakteri içeriyor. Diş kazıma, yiyecek, toprak, su, dışkı maddesi ve hatta sterilize edilmemiş mikrobiyolojik ortamlarda bulunurlar. Herhangi bir bakteri içeren malzemenin homojen süspansiyonunun belirli bir miktarı sterilize edilmiş ortama aseptik olarak aşılanır ve bir inkübatörde 24 saat 37 ° C'de inkübe edilir.

Sıvı et suyunda bakteri süspansiyon halinde büyür ve bulanık hale getirir. Katı agar plakalarda koloniler halinde büyürler; her bir koloni tek bir bakteriden büyür. Bakterilerin ekimi takip eden beş adımda gerçekleştirilir.

1. Medya hazırlanması

2. Medya ve cam eşyaların sterilizasyonu

3. Aşılama

4. Kuluçka

5. Gözlem

1. Medya Hazırlığı:

Genellikle, sıvı et suyu ve yarı katı besiyerinin hazırlanmasında, bileşenler belirtilen oranlarda tartılır ve gereken miktarda su içinde çözülür. Şu anda, malzemeleri gerekli oranlarda içeren hazır ortam tozları mevcuttur.

Sıvı et suyu ortamının hazırlanmasında, belirtilen miktarda toz (paketin etiketinde belirtildiği gibi) konik bir şişede istenen miktarda su içinde tartılır ve çözülür. İçerikler ısınmak suretiyle eritilir, test tüplerine dökülür ve otoklavda sterilize edilir.

Ancak, katı plakaların, eğiklerin ve derin tüplerin hazırlanmasında, belirtilen miktarda toz (paketin etiketinde belirtildiği gibi) konik bir şişede istenen miktarda su içinde tartılır ve çözülür. Bu hazırlanan ortam önce otoklavda sterilize edilir ve daha sonra bir süre soğumaya bırakılır.

Hala sıcakken, katılaşmadan önce, sterilize edilmiş Petri kaplarına veya test tüplerine dökülür ve oda sıcaklığına soğutulduktan sonra katılaşmaya bırakılır. Medya, çok sıcak koşullarda, medyanın yüzeyinde düşen ve kirlenmesine yol açabilecek kapların çeperinde suyun yoğunlaşmasına yol açtığından, asla kaplara dökülmemelidir.

2. Sterilizasyon:

Cam ürünler, sıcak hava fırınında 180 ° C'de 3 saat sterilize edilir ve ortam, otoklavda 121 ° C'de (15 psi basınç) 15 dakika süreyle sterilize edilir. Züccaciye otoklavda da sterilize edilebilir, ancak ortamdan su kaçtığı ve kuruması sırasında ortam asla fırında sterilize edilmemelidir.

3. Aşılama:

Sıvı numunelerin homojen bakteri süspansiyonları olduğu varsayılmaktadır. Bu nedenle, broth ekimi için, numunenin belirli bir hacmi aseptik olarak broth içine pipetlenir. Agar plakaları üzerinde yetiştirme için, numunenin belirli bir hacmi katı agar plakasına pipetlenir ve aseptik olarak ortamın yüzeyine yayılır.

Katı numuneler için, belirli bir ağırlık numunesi, steril bir havaneli ve harç veya bir blender kullanarak belirli bir normal fizyolojik salin hacminde (% 0, 85 sodyum klorür) belirli bir hacimde aseptik olarak homojenleştirilir. İnsan patojenlerinin çoğu insan vücuduna izotoniktir (% 0.85 sodyum klorür).

Genellikle numunenin saline oranı 1: 9'dur (1g + 9 ml; 10g + 90 ml; 25g + 225 ml veya 50g + 450 ml). Homojen bir bakteri süspansiyonu olduğu kabul edilen bu homojenize sıvının belirli bir hacmi, et suyu kültürü için test tüplerinde sterilize edilmiş et suyuna aseptik olarak pipetlenir. Agar plakalarda kültür için, sıvı süspansiyon plakaların yüzeyine pipetlenir ve aseptik olarak yayılır.

Katı yüzeylerin (masa üstü, vücut yüzeyleri veya yaraların) mikrobiyolojisini incelemek için alınan yüzey örnekleri için, yüzey sterilize bir bezle ovulur. Çubuğa steril bir agar plakanın yüzeyine dokunulur. Dokunma noktasından itibaren çizgiler bakterileri izole etmek için aseptik olarak sterilize edilmiş ilmekle yapılır.

4. Kuluçka:

Aşılanan et suyu tüpleri ve plakaları bir inkübatörde 24 saat 37 ° C'de inkübe edilir.

5. Gözlem:

Sıvı çorbadaki bulanıklık ve agar plakalarındaki koloniler bakteri üremesini gösterir.

Gerekli Malzeme:

Petri kapları (6 adet), 2 ml'lik pipetler (5 adet), test tüpleri (5 adet), konik şişeler (her biri 100 ml, 250 ml ve 500 ml-1), 250 ml'lik beher (2 adet), cam yayıcı, paslanmaz çelik pipet kasası, kraft kağıt, iplik (veya lastik bant), emici olmayan pamuk, küçük çubuklar, ilmek, etil alkol, sodyum klorür (NaCl), 0.1N hidroklorik asit (HCI), 0.1N sodyum hidroksit (NaOH ), distile su, besin suyu, besin agarı, sıvı numune (örn. havuz suyu), katı numune (örn. toprak), yüzey örneği (örn. masa üstü, vücut yüzeyi, yara), pH kağıdı (veya pH metre), havaneli ve harç (veya homojenleştirici), bunsen brülörü, sıcak hava fırını, otoklav, inkübatör, laminer akış odası.

Prosedür:

1. Beş pipet (paslanmaz çelik pipet kasasında), altı petri kabı ve bir çift havaneli ve harç (veya bir homojenleştirici kabı) sıcak hava fırınında 180 ° C'de 3 saat sterilize edilir. Alternatif olarak, bunlar kraft kağıdı ile kaplanabilir, iplik veya lastik bant ile bağlanabilir ve ortam ile birlikte otoklavda sterilize edilebilir (Şekil 6.1).

2. 0.85 g NaCl, 250 ml'lik bir beher içinde 100 ml damıtılmış su içinde çözülür ve 90 ml'lik bu salin çözeltisi, 100 ml'lik bir konik şişeye dökülür. Ağız pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

3. 100 ml et suyu için gerekli olan besiyeri et suyu ortamının içerikleri tartılır. Alternatif olarak, önceden hazırlanmış hazır besin broth tozu (bileşen karışımı) tartılır.

4. Bileşenler (veya hazır toz), çalkalanarak ve döndürülerek, 250 ml'lik bir konik şişede, 100 ml damıtılmış suda çözündürülür. PH, bir pH kağıdı veya pH metre kullanılarak belirlenir. PH daha fazla ise 0.1N HCI kullanarak veya daha düşükse 0.1 N NaOH kullanılarak 7.0'a ayarlanmıştır. Şişe, gerekirse bileşenleri tamamen çözmek için ısıtılır.

5. Et suyu 5 test tüpüne dağıtılır (her biri yaklaşık 10 ml), ağızları pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

6. Besleyici agar besiyerinin içerikleri veya 200 ml besiyeri için gereken hazır toz tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 500 ml konik bir şişede 200 ml distile suda çözülür.

PH değeri, bir pH kağıdı veya pH ölçer kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HC1 kullanılarak 7.0'a veya daha azsa 0.1N NaOH kullanılarak 7.0'a ayarlanır. Şişe, agarı besiyerinde tamamen çözmek için ısıtılır. Daha sonra, pamuk tıkanmış, kraft kağıt ile kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

7. Swablar, küçük çubukların uçları etrafına pamuk sarılarak yapılır. Bu gibi birkaç bez, pamuk uçları aşağıya doğru olan bir test tüpünde tutulur. Test tüpü koton tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

8. 90 ml serum fizyolojik içeren 100 ml'lik konik şişesi, besin maddesi içeren 5 test tüpü, 200 ml besin agar ortamı içeren 500 ml'lik konik şişesi ve swabları içeren test tüpü, 121 ° C'de (15 psi basınç) sterilize edilmiştir. Otoklavda 15 dakika.

9. Sterilizasyondan sonra, sterilize edilmiş malzemeler otoklavdan çıkarılır ve ortamın katılaşmasına izin vermeden bir süre soğumaya bırakılır. Ortamın soğutulması plakaların içinde su damlacıklarının yoğunlaşmasını ve birikmesini önler. Ortam, depolama sırasında önceden hazırlanmış ve katılaşmışsa, tamamen eriyene kadar dikkatlice ısıtılarak sıvılaştırılmalıdır.

10. Besleyici agar plakaları hazırlamak için, sterilize edilmiş besleyici agar besiyeri soğumadan ve katılaşmadan önce, ılık erimiş halde, aseptik olarak, 6 sterilize edilmiş petri kabının içine (her biri yaklaşık 20 mi) dökülür, böylece erimiş ortam, altı tamamen petri kapları.

Sonra, plakalar kapaklarıyla kapatılır ve içindeki ortamı katılaştırmak için soğumaya bırakılır. Plakaların ve kapakların iç yüzeyinde yoğunlaşabilen su buharı, plakaları ve kapaklarını bir inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık 1 saat süreyle ters konumda tutularak buharlaştırılır.

11. Sıvı numunesi (bakteri içerdiğinden şüpheleniliyor, örneğin havuz suyu). Örneklerin her biri bir ml, 2 et suyu tüpüne aseptik olarak pipetlenir (Şekil 6.2). Tüpler döndürüldü. Sıvı numune ayrıca her biri 0.1 ml olan 2 agar plakaya aseptik olarak pipetlenir ve bir alev sterilize cam dağıtıcı kullanılarak agar ortamının yüzeyine yayılır.

Her bir cam serpme makinası tarafından yayılmadan önce, alkole batırılır ve bunsen ocağı üzerine alevlenir. Aşılanan et suyu tüpleri ve plakaları bir inkübatörde 24 saat 37 ° C'de inkübe edilir. Plakalar ters çevrilmiş, yukarıdan aşağıya inkübe edilir.

12. Katı numune için (örneğin toprak), 10 g numune aseptik olarak tartılır ve 100 ml konik balondan 90 ml steril salin eklendikten sonra sterilize edilmiş havan ve harç veya homojenleştirici kabında homojenleştirilir.

Bu homojen bakteri süspansiyonu, adım 11'deki gibi 2 broth tüpü ve 2 agar plakasına aseptik olarak pipetlenir ve inkübatörde 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir (Şekil 6.2). Plakalar ters çevrilmiş, yukarıdan aşağıya inkübe edilir.

13. Yüzey örneklemesi için bakteri (masa üstü, vücut yüzeyi, yara) içerdiğinden şüphelenilen yüzey, sterilize bir bezle ovalanmış bir ünite alanı (örneğin 1 cm ² ) için işaretlenir. Çubuğa, dışarıda bırakılan iki agar plakasının yüzeyine dokunulur.

Şeritleme, aseptik olarak alevle sterilize edilmiş bir halka ile yapılır. Çizgiler için, çubukla dokunma noktasından döngü tarafından neredeyse paralel çizgiler çizilir. Bunlar birincil çizgileri oluşturur. Döngünün alevle sterilizasyonundan sonra, ikincil çizgiler, birincil çizgilere neredeyse çapraz olarak çekilir. Benzer şekilde, tersiyer ve kuaterner çizgileri de aseptik olarak yapılır.

14. Ardından, plakalar inkübatörde 24 saat boyunca 37 ° C'de yukarıdan aşağıya doğru ters pozisyonda inkübe edilir (Şekil 6.2).

15. Bir inoküle edilmemiş agar plakası ve bir inoküle edilmemiş bir et suyu tüpü, içlerinde büyüme olmadığı şekilde belirtildiği gibi uygun sterilizasyonun sağlanması için kontrol olarak inkübe edilir. Bu adım isteğe bağlıdır.