Hidroliz DNA'ya Yeteneklerini Bulmak için Bakteriler Üzerinde Deoksiribonükleaz Testi (Şekil)

DNA'yı hidrolize etme yeteneklerini bulmak için bakterilerde deoksiribonükleaz testi (DNase testi) (Şekil ile)!

Prensip:

Bazı bakteriler deoksiribonükleik asidi (DNA) oligonükleotitlere hidrolize etme kabiliyetine sahiptir çünkü ekstraselüler hidrolitik enzim 'deoksiribonükleaz' (DNaz) üretebilirler.

DNA, opaklık üreten hidroklorik asit ile çökeltilirken, hidrolize edilmiş son ürünleri olan oligonükleotitler, bu opaklığı üretmeyen hidroklorik asit tarafından çökelmez; şeffaflığı sağlamak yerine.

DNase testinde, test bakterileri DNA içeren agar plakaları üzerinde büyütülür. Bakterilerin kolonileri göründükten sonra, plakalar hidroklorik asit ile sulandırılır. Bakteriler DNA'yı hidrolize etme kabiliyetine sahipse, kolonileri DNA'yı çevreleyen alanlarda ortam içinde hidrolize ederken, plakaların geri kalan kısımları hidrolize edilmemiş DNA içerir.

Sonuç olarak, hidroklorik asit ile sulandırıldığında koloniler etrafında saydam berrak bölgeler oluşur; hidrolize ürünler, etraflarında oluşan oligonükleotitler, hidroklorik asit ile çökelti oluşturmazlar.

Öte yandan, bu alanlardaki hidrolize olmamış DNA, hidroklorik asit ile çökeltildiğinden, plakaların geri kalan bölümlerinin opak olduğu görülmektedir. Hidroklorik asit yerine toluidin mavisi kullanılırsa, sadece kolonilerin çevresinde pembe bir pembe halo üretilir.

Gerekli malzemeler:

Petri kapları, konik şişesi, pamuk tıkaçları, aşılama döngüsü, otoklav, bunsen brülör, laminer akış haznesi, atma kavanoz, kuluçka makinesi, DNase agar, İN hidroklorik asit (veya% 0.1 toluidin mavisi), izole koloniler veya saf bakteri kültürleri.

Prosedür:

1. İki petri kabı temizlenir, kağıtla kaplanır ve iplik veya lastik bantla bağlanır (Şekil 7.23). Bu adım ve ayrıca 6. adımda petri kaplarının sterilizasyonu, eğer fırında sterilize edilmiş petri kaplarının doğrudan kullanılması durumunda atlanır.

2. DNase agar besiyerinin (ana bileşen olarak DNA içeren) veya 100 ml besiyeri için gereken hazır tozunun içerikleri çalkalanarak ve döndürülerek 250 ml'lik bir konik şişede 100 ml damıtılmış su içinde tartılır ve eritilir.

3. pH değeri, bir pH kağıdı veya pH metre kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HCI kullanılarak veya daha azsa 0.1N NaOH kullanılarak 7.2'ye ayarlanır.

4. Şişe, agarı ortam içinde tamamen çözmek için ısıtılır.

5. Şişe pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

6. İki petri kabı ve DNase agar ortamı içeren konik şişesi, bir otoklavda 15 dakika boyunca 121 ° C'de (15 psi basınç) sterilize edilir.

7. Sterilizasyondan sonra, otoklavdan çıkarılır ve ortamın katılaşmasına izin vermeden bir süre soğumaya bırakılır. Ortamın soğutulması plakaların içinde su damlacıklarının yoğunlaşmasını ve birikmesini önler. Ortam, depolama sırasında önceden hazırlanmış ve katılaşmışsa, tamamen eriyene kadar dikkatlice ısıtılarak sıvılaştırılmalıdır.

8. DNase agar plakalarını hazırlamak için, sterilize edilmiş DNase agar besiyeri soğumadan ve katılaşmadan önce, ılık ve ılık bir halde, aseptik olarak, tercihen bir laminer akış odasının içine, iki sterilize edilmiş petri kabına (her biri yaklaşık 20 ml) dökülür. erimiş ortam, petri kabının tabanını tamamen kaplar.

Sonra, plakalar kapaklarıyla kapatılır ve içindeki ortamı katılaştırmak için soğumaya bırakılır. Plakaların ve kapakların iç yüzeyinde yoğunlaşabilen su buharı, plakaları ve kapaklarını bir inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık 1 saat süreyle ters konumda tutularak buharlaştırılır.

9. Her plaka alt tarafta dörtte üçü olarak işaretlenmiştir.

10. Test bakterilerinin "spot inokülasyonu", alevle sterilize edilmiş bir ilmek yardımı ile bakterilerin bir spotunu (veya küçük bir lekesini) yaparak her çeyreğin ortasındaki aseptik olarak, tercihen laminer bir akış odasının içinde yapılır. Her aşılamadan sonra döngü sterilize edilir.

11. Aşılanmış plakalar, bakteri kolonileri görünene kadar inkübatörde, yukarıdan aşağıya, 37 ° C'de 24 ila 48 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edilir.

12. Plakalar, 1 N hidroklorik asit çözeltisi (veya% 0.1 toluidin mavisi) ile yıkandı.

Gözlemler:

1. Koloniler çevresinde oluşan saydam saydam alanlar (veya pembe halo): DNaz pozitif.

2. Koloniler etrafında oluşmayan şeffaf saydam bölgeler (veya pembe halo): DNaz negatif.