DNA Replikasyonu: DNA Replikasyonu, Onarımı ve Rekombinasyonu Üzerine Notlar

DNA Replikasyonu, Onarımı ve Rekombinasyonu Üzerine Notlar!

DNA kopyalama:

Yarı koruyucu DNA replikasyonu:

DNA replikasyonu, DNA'nın otokatalitik bir fonksiyonudur. Kromozomlar oldukça genişletilmiş formda olduğunda, genellikle hücre döngüsünün S fazı sırasında meydana gelir. Watson ve Crick tarafından önerildiği gibi, DNA replikasyonu yarı muhafazakardır.

Yarı koruyucu replikasyonda, iki şerit birbirinden ayrılır, bütünlüğünü korur ve her biri, nükleotitler havuzundan tamamlayıcı zincirini sentezler. Sonuçta, yeni sentezlenen molekülün iki iplikçikten birini ana molekülten taşıyacağı veya koruyacağı ve diğer iplikçik yeni toplanacaktı. Çift sarmallı DNA'nın yarı-konservatif yöntemle gerçekten çoğaldığını kanıtlamak için yeterli kanıt vardır.

Meselson ve Stahl'ın Deneyi (1958):

Bu işçiler Escherichia coli'yi ¹⁵ N izotop içeren bir ortamda kültürledi. Bunlar, bu ortamdaki bazı nesiller için çoğaltıldıktan sonra, bu DNA'nın liflerinin her ikisi de pürinler ve pirimidinlerin bileşenleri olarak ¹⁵ N içerdi. ¹⁵ N içeren bu bakteriler, ¹⁴ N içeren bir kültür ortamına aktarıldığında, taze nesil bakterilerden ayrılan DNA'nın, diğerinden daha ağır bir iplikçik içerdiği bulundu.

Daha ağır olan iplikçik, ana ipliği temsil eder ve daha hafif olanı kültür ortamından sentezlenen yeni olandır, bu nedenle yarı-konservatif DNA replikasyonu metodu ve hem konservatif hem de dispersiyonel DNA sentezi ve replikasyon modelleri hariç tutulur.

Muhafazakar replikasyon, “hibrit” yapıya sahip herhangi bir DNA molekülü üretmez. Eğer çoğaltma dağıtıcı olsaydı, DNA'nın her nesilde “ağır” dan “ışığa” kayması olurdu.

Müteakip çalışmalar Meselson ve Stahl'ın DNA replikasyonunun yarı koruyucu olduğu sonucuna vardığını ve bunu daha yüksek bitki ve hayvanlar da dahil olmak üzere diğer birçok organizmaya genişlettiğini doğruladı.

Cairn'in otoradiografi deneyi:

Radyoaktif timin veya ezilmiş timidin kullanıyordu. Eritin timidin içeren bir kültür ortamında E.coli büyütülerek, radyoaktivite, yeni DNA moleküllerine dahil edildi.

Otoradyografide, kopyalayan DNA molekülü, iki zincirin dört olduğu nokta olan bir çoğaltma çatalı gösterir. İlk replikasyondan sonra, radyoaktivitenin, DNA ipliklerinden sadece bir tanesine dahil edildiği görülmekte ve her iki ipliğin de ikinci replikasyondan sonra etiketlendiği görülmüştür. Bu, yarı-muhafazakar DNA replikasyon modlarını destekler.

JH Taylor’ın Viciafaba kök uçları (1957) konusundaki deneyleri, yarı muhafazakar DNA replikasyon yöntemini de doğrulamaktadır.

ben. Süreksiz DNA replikasyonu:

Okazaki, DNA sentezinin aynı enzim DNA polimerazı kullanan küçük DNA parçaları üzerinde eş zamanlı olarak ilerlemesini önerdi. Bu bölümler Okazaki parçaları olarak bilinir ve 1000-2000 nükleotitten oluşur. Bunlar, polinükleotit zincirinin oluşumunu tamamlayan polinükleotit ligaz enzimi ile birleştirilir.

Kesintisiz DNA sentezi, otomatik radyografik deney ile desteklenir.

ii. DNA'nın Tek Yönlü ve Çift Yönlü Replikasyonu:

J. Cairns, deneylerinden DNA sentezinin kromozomlar üzerinde sabit bir noktada başladığı ve bir yönde ilerlediği sonucuna vardı, ancak son deneyler çift yönlü replikasyona işaret ediyor.

Levinthal ve Cairns, replikasyon sırasında, iki tutamın replikasyondan önce tamamen ayrılmamasını önerdi. Bunun yerine bir ucunda açmaya başlarlar ve eşzamanlı olarak açılmış bölümler nükleotit çiftlerini çekmeye başlar. Bu şekilde, orijinal DNA iplikçiklerinin çözülmesi ve taze DNA iplikçiklerinin sentezi yan yana gider.

DNA polimeraz:

DNA polimeraz, DNA replikasyonunun temel enzimidir. Aktivitesi ilk olarak 1956'da Kornberg tarafından gösterildi. Astar adı verilen önceden var olan bir nükleotidin 3′-OH'üne kovalent deoksiribonükleotitlerin eklenmesini katalize eder.

DNA polimeraz-1 enziminin şimdi bir replikasyon enziminden ziyade bir DNA tamir enzimi olduğu düşünülmektedir. Bu enzimin, şablon bölgesi, primer bölgesi, 5 '-> 3 ′ bölünme veya eksonükleaz bölgesi, nükleosit trifosfat bölgesi ve 3' -> 5 ea bölünme bölgesi (veya 3 '-> 5 ′ ekzonükleaz bölgesi) olmak üzere beş aktif bölgeye sahip olduğu bilinmektedir. ).

DNA polimeraz I:

Esas olarak, 5 '-> 3 ′ polimerizasyon kapasitesine bağlı olarak RNA primerlerinin Okazaki veya öncül parçalardan çıkarılması ve sonuçta ortaya çıkan boşlukların doldurulması ile ilgilidir. DNA polimeraz I enzimi ayrıca UV ışıması nedeniyle üretilen timin dimerlerini giderebilir ve eksizyon nedeniyle boşluğu doldurabilir. Buna, bu enzimin ispat okuma veya düzenleme işlevi denir.

DNA polimeraz-II:

Bu enzim, DNA polimeraz-I'in aktivitesine benzer, ancak bir DNA tamir enzimidir ve serbest 3′-OH grupları kullanarak 5 '-> 3' yönde büyümeyi sağlar.

DNA polimeraz-III:

DNA replikasyonunda önemli bir rol oynar. Α, β, ε, θ, г, y, δ, δ ', x ve Ψ gibi on alt birime sahip multimerik bir enzim veya holoenzimdir. Bütün bu on alt birim, in vitro DNA replikasyonuna ihtiyaç duyuyor; ancak, hepsi farklı işlevlere sahiptir. Örneğin, α alt birimi, 3 '-> 5 ′ eksonükleaz prova okuma veya düzenleme aktivitesine sahiptir. Çekirdek enzim üç alt birimden (a, β ve θ) oluşur. Kalan yedi alt birim, işlemciliği arttırır (işlemlilik, bir DNA polimerazın büyüyen zinciri uzattığı hızlılık ve verimlilik anlamına gelir).

Ökaryotik DNA polimeraz:

Eukai yotes (örneğin, maya, sıçan karaciğeri, insan tümör hücreleri), aşağıdaki beş tip DNA polimerazı içerdiği bulunmuştur:

(i) DNA polimeraz a:

Bu nispeten yüksek moleküler ağırlıklı enzime sitoplazmik polimeraz veya büyük polimeraz da denir. Hem çekirdek hem de sitoplazmada bulunur.

(ii) DNA polimeraz β:

Bu enzime nükleer polimeraz veya küçük polimeraz da denir ve yalnızca omurgalılarda bulunur.

(iii) DNA polimeraz y:

Bu enzime mitokondriyal polimeraz denir ve çekirdekte kodlanır.

(iv) DNA polimeraz δ:

Bu enzim memeli hücrelerinde bulunur ve PCNA, DNA sentezi işleyişine bağlıdır (PCNA = çoğalan hücre nükleer antijeni).

(v) DNA polimeraz ε:

Daha önce DNA polimeraz 5II olarak biliniyordu. Bu enzim PCNA'dan bağımsızdır ve memeli HeLa hücrelerinde ve tomurcuklanan mayada bulunur.

Büyük DNA polimeraz a, baskın olan DNA polimeraz enzimidir, ökaryotik hücrelerdir ve DNA replikasyonunda rol oynayan tek enzimin uzun zamandan beri olduğuna inanılıyordu. Fakat şimdi bir başka polimeraz, yani DNA polimeraz 8'in, ökaryotik DNA replikasyonunda rol oynadığı bulunmuştur.

DNA Primerleri:

Bu enzimler, organizmaların çoğunda DNA replikasyonunun başlatılması için ön şart olan RNA primerlerinin sentezini katalize eder. Gerçek DNA replikasyonu başlamadan önce, RNA primerleri veya basitçe primerleri adı verilen kısa RNA oligonükleotit segmentleri, ribonükleosit trifosfatları kullanan DNA primaz enzimi tarafından sentezlenmelidir.

Bu RNA primer, bir DNA zincirinden belirli bir baz sekansın kopyalanmasıyla sentezlenir ve sentezden sonra primer DNA şablonuna hidrojen bağlı kalması için tipik bir RNA molekülünden farklıdır.

Primerler ökaryotlarda yaklaşık 10 nükleotittir ve her okazaki fragmanını başlatmak için DNA polimeraz enzimi tarafından uzatıldıkları gecikmeli iplik üzerinde aralıklarla yapılırlar. Bu RNA primerleri daha sonra eksize edilir ve ökaryotlardaki DNA onarım sistemi yardımı ile DNA ile doldurulur.

Bakterilerde iki farklı enzimin primer RNA oligonükleotitleri - RNA polimerazı (önde gelen iplikçikte) ve DNA primazını (geciken iplikçikte) sentezlediği bilinmektedir.

Polinükleotid Ligaz:

Bu enzim, hem DNA replikasyonu hem de DNA onarımında önemli bir enzimdir. DNA ligaz bir nükleotidin 5′-fosforil grubu ile bir DNA şeridindeki bir nickin yanındaki hemen komşunun 3-OH grubu arasındaki fosfodiester bağlantısının oluşumunu katalize eder; Böylece, bir DNA zincirindeki kertikleri kapatır.

endonükleazlardır:

Endonükleazlar, özellikle kısıtlayıcı endonükleazlar, DNA replikasyonu ve DNA onarımı sırasında da önemlidir. DNA replikasyonu sırasında, bir endounclease replikasyonu başlatmak için orijinde bir nick üretebilir veya DNA'nın gevşemesini kolaylaştırmak için bir dönüş oluşturmak için çentikler oluşturabilir.

DNA Sarmalının Açılmasına Katılan Enzimler:

DNA sarmalları:

DNA helikazları, iki ana iplikçiklerin ayrılmasını destekleyen ve aşamalı olarak kökeni uzağa doğru hareket edecek replikasyon çatalları oluşturan ATP'ye bağlı açılma enzimleridir. Şablon DNA sarmalının bir çoğaltma çatalında gevşetilmesi ilke olarak, biri önde gelen dizi boyunca uzanan ve diğeri geciken dizi boyunca uzanan konserde hareket eden iki DNA helikası ile katalize edilebilir.

Helezon kararsızlaştırıcı iplikçik (ayrıca tek iplikçikli DNA bağlayıcı proteinler veya SSBP'ler de denir):

Replikasyon çatalının arkasında, tek DNA iplikçiklerinin SSB proteinlerinin etkisiyle birbirlerine sarılmaları (veya her bir iplikçide çift iplikli saç tokası halkaları oluşturma) önlenir. SSB proteinleri, maruz kaldıkları DNA iplikçiklerine bağlanarak bazları örtmeden bağlar, bu nedenle şablonlama işlemi için uygun kalır.

Topoizomerazlar (DNA gyrases):

Bir helisazın etkisi, çoğaltma çatalının önündeki dupleks DNA'ya pozitif bir süper bobin verir. Topoizomerazlar adı verilen enzimler, geçici süper bobin dubleksine bağlayarak, iplikçiklerden birini çekiştirerek ve kırılmamış iplikçik boyunca döndürerek süper bobini gevşetir. Nick daha sonra tekrar kapatılır.

Bir tür topoizomeraz (yani, topoizomeraz I), nickin her iki tarafındaki DNA sarmalının iki bölümünün birbirine göre serbest bir şekilde dönmesine izin veren, telin karşısındaki fosfodiester bağını kullanarak, tek iplikçik kopmasına veya nickine neden olur. dönme noktası. İkinci tip bir topoizomeraz (yani, topoizomeraz II), aynı anda hem DNA sarmalının her iki koluna kovalent bir bağ oluşturur, hem de sarmalda geçici çift sarmallı kopma yapar.

Replicon:

Bir replikon, bireysel replikasyon eylemlerinin gerçekleştiği DNA birimidir, yani DNA'nın diğer segmentlerinden bağımsız olarak DNA replikasyonu yapabilir. Bu nedenle, her bir replikon, çoğaltmanın başlatıldığı bir kökene sahiptir ve çoğaltmanın durduğu bir terminusu olabilir.

Bakteriyel ve viral kromozomlar genellikle tek bir replikon / kromozom içerir. Her ne kadar faj T, bir birincil ve bir ikincil olmak üzere iki kökene sahip olmakla birlikte, birincil köken varlığında ikincil köken, kural olarak, işlevsel değildir. E. coli'de menşe noktası genetik lokus oriC olarak tanımlanır.

Tam bir prokaryotik orijin aşağıdaki üç işlevi desteklemektedir: (1) çoğaltmanın başlatılması, (2) başlatma olaylarının sıklığının kontrolü ve (3) çoğaltılmış kromozomların yeni hücrelere ayrılmasının kontrolü.

Kökenler bakteri, maya, kloroplast ve mitokondride tanımlanmıştır; Onların önemli genel özelliği, replikasyon sırasında gevşemede kolaylık için önemli olabilecek A: T yönünden zengin olmalarıdır. Bakteriyel orijin işlevi için ihtiyaç duyulan birçok farklı kısa (<10 bp) bölge içerir; bu siteler bazen belirli mesafelerle ayrılır, ancak belirli dizilerle ayrılmaz. Bu spesifik olarak yerleştirilmiş siteler, DNA replikasyonunda yer alan farklı proteinlerin bağlanması için gereklidir.

Birkaç prokaryotik replikon, terminus adı verilen ve replikasyon çatalı hareketini durduran ve böylece DNA replikasyonu sonlandıran spesifik bölgelere sahiptir. E. coli kromozomunun, replikasyon çatallarının birleştiği noktanın her iki yanında yaklaşık 100 Kb bulunan T1 ve T2 adı verilen iki termini vardır. Her uç bir çatal hareket yönü için spesifiktir.

T1 ve T2, her bir çatalın kendine özgü terminusa ulaşmak için diğerini geçmesi gerekecek şekilde düzenlenir. Replikasyon sonlandırması, muhtemelen T ve T2'yi tanıyan bir proteini kodlayan tus geninin ürününü gerektirir.

Ökaryotlarda, her bir kromozomun birçok replikonu vardır (örneğin, maya, 500; Drosophila, 3, 500; fare 25, 000; Viciafaba, 35, 000). S evresi sırasında herhangi bir noktada, bu replikonların sadece bir kısmı replikasyona uğrar; Her bir replikon belirli bir sırada belirli bir sırada etkinleştirilmiş gibi görünüyor. Ökaryotik bir replikonun uzunluğu, mayada 40 Kb ve Vicia'da Drosophila ile yaklaşık 300 Kb arasında değişebilir.

Tespit edilebilir replikonların sayısı gelişim evresine ve hücre veya doku tipine göre değişebilir. Bu, dokuya özgü kökenler temelinde açıklanır, böylece bazı kökenler, bazı dokularda aktifken diğerleri, diğer bazı dokularda etkindir.

Bu, erken embriyonik hücrelerin yetişkin somatik hücrelerinde 10 kat daha fazla replikon içerdiği Drosophila tarafından örneklenmiştir. Elde edilen kanıtlar ökaryotik replikonların terminiinin olmadığını göstermektedir.

Çoğaltmanın Doğruluğu:

DNA replikasyonunun hata oranı, genetik mesajın anlamını bir nesilden diğerine koruma ihtiyacından dolayı transkripsiyondan çok daha düşüktür. Örneğin, E. coli'deki spontan mutasyon oranı, replikasyon sırasında dahil edilen 1010 baz başına yaklaşık bir hatadır.

Bunun temel nedeni, baz eşleştirme özelliklerinde değişiklik yapan bazların küçük tautomerik formlarının mevcudiyetidir. Hata oranı çeşitli mekanizmalarla en aza indirgenir. DNA polimerazları sadece gelen bir nükleotidi, aktif bölgesinde şablon nükleotit ile doğru baz çiftini oluşturuyorsa içerecektir.

Ara sıra hata, polimeraz ile ilişkili 3 '-> 5 ′ okumayan eksonükleaz tarafından tespit edilir. Bu, yanlış nükleotidi herhangi bir ilave birleştirme işleminden önce 3′-uçtan uzaklaştırır ve polimerazın daha sonra doğru bazın yerleştirilmesine izin verir. Düzeltme işleminin eksonükleazın düzgün çalışması için doğru taban çiftini yanlış olandan ayırt edebilmesi gerekir.

Yeni başlatılan gecikmeli iplikçik parçacıklarının 5′-ucunda 'bağlanmamış' baz çiftlerinin hareket kabiliyeti, hiçbir zaman doğru görünmeyecekleri ve bu yüzden kanıtlanamayacakları anlamına gelir. Bu nedenle, ilk birkaç nükleotit, ribonükleotidlerdir (RNA), böylece daha sonra düşük kaliteli materyal olarak tanımlanabilir ve bitişik fragmandan uzatılmış (ve tekrar okunan) DNA ile değiştirilir. Düzeltme işleminden kaçan hatalar, bir uyumsuzluk onarım mekanizması tarafından düzeltilir.

Prokaryotlarda DNA Replikasyon Mekanizması:

E. coli'de ve E. coli'nin fajları ve plazmitlerinde in vitro DNA replikasyonu kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır. E. coli'de, DNA çoğaltma işlemi aşağıdaki üç ana adımı içerir:

1. DNA replikasyonunun başlatılması:

Bu işlem üç adımdan oluşur: (i) tek sarmallı bir DNA bölgesi oluşturmak için DNA dupleksinin açılışı (O), (ii) DNA'nın açılması ve (iii) Dna B proteininin (yani, 5 ′3 ′ helikazid) yakalanması ayrıca primazın aktivatörü olarak da işlev görür). Böylece, Dna-A (veya başlatıcı proteini) ATP kompleksi, 9 bp'lik tersine çevrilmiş tekrar bölgelerine (R,, R,, R _v R4), E. coli'nin oryan C'sine bağlanır ve DNA dubleksinin üçlü bir bölgede açılmasını destekler. 13-bp dizisinin doğrudan tekrarları (13-mer adı verilir).

Açıklık 13-mer'den sağa doğru gerçekleşir ve negatif şekilde aşırı sarılmış DNA ve HU veya IHF başlatıcı proteinleri gerektirir. DNA B (-helikaz) açığa çıkmış tek iplikçikli DNA'ya aktarılır ve DNA'nın A TP, SSB proteini ve DNA gyrase (bir topoizomeraz) varlığında çözülmesine neden olur.

Bu, DNA dupleksinin çözülmesiyle sonuçlanır ve ori C'den replikasyon her iki yönde de ilerler (çift yönlü); SSB bağlaması, tek sarmallı bölgelerde meydana gelir ve iki sarmal B kompleksi (= primozom), her bir sarmalda bir tane yüklenir.

2. DNA zincirinin uzaması:

Bu adım, aşağıdaki enzimlerin ve faktörlerin varlığını gerektirir: 1. Dna B veya helikaz (mobil promotör olarak da bilinir); 2. primaz (Dna G); 3. DNA polimeraz holoenzimi (veya DNA pol III HE); 4. SSB proteini; 5. RNA primerlerini gideren RNAase H; 6. RNA primerleri ve 7. primer içermeyen okazaki fragmanlarını sürekli ipliklere dönüştüren) nedeniyle oluşan boşluğu doldurmak için kullanılan DNA polimeraz I. Uzama geçişine başlama sırasında, aşağıdaki olaylar meydana gelir:

(i) Helikaz (veya Dna B) 5 ′ -> 3 ′ yönde hareket ettiğinde, DNA dupleksini açarak bir çoğaltma çatalı oluşturur.

(ii) Helikaz içeren DNA zinciri gecikmeli iplik haline gelir. DNA primazı Dna B helikaz ile birleşerek, iplikçiyi geciktirmek için çoklu primerleri ve öncü iplikçik için tek RNA primerini sentezleyen primozomu oluşturur.

(iii) Geciken telin sentezi için, DNA pol III HE, Dna B sarmalının bağlı olduğu aynı tel üzerinde çalışmalıdır, ancak ters yönde hareket eder.

(iii) DnaB helikaz, Dna Gprimaz ve DNA pol III FIE, iplikçik uzamasında birlikte çalışır. Helikaz ve DNA polimeraz düzeneği işlemsel kalır, yani, çatala sıkıca bağlı kalır ve reaksiyon boyunca bağlı kalır.

Gecikme ve öncül ipliklerin sentezi (- uzaması) biraz farklı yöntemlerle gerçekleşir; iplikçik geciktirmek için önde gelen iplikçikten çok daha karmaşıktır:

(A) Gecikmeli şeritte süreksiz sentezi:

1. Primaz çözeltiden alınır ve geciken iplikçik üzerinde aRNA primeri (10 ila 20 nt veya uzun nükleotitler) sentezlemek için helikaz (DnaB) ile aktive edilir.

2. RNA primerleri, geciken tel üzerindeki DNA pol III HE tarafından tanınır ve prekürsör veya okazaki fragmanlarının sentezi için kullanılır. Aslında, her yeni RNA primeri, DNA pol III HE'nin gama (y) alt birimi tarafından tanınır ve aynı polimerazın p alt birimi ile yüklenir. Bu önceden yüklenmiş p alt birimi, önceki okazaki fragmanındaki sentetik işini bitirdikten sonra mevcut olduğunda DNA poly III HE'nin çekirdeğini yakalayabilir.

3. Okazaki fragmanlarının tamamlanmasından sonra, RNA primerleri DNA polimeraz 1 tarafından çıkarılır, bu daha sonra ortaya çıkan boşlukları DNA ile doldurur.

4. DNA polimeraz I, kesilen primer tarafından bırakılan boşluğa son deoksiribonükleotitleri ekledikten sonra, DNA ligaz enzimi, primer replasmanının serbest 3 ′ ucunu okazaki fragmanının 5 ′ ucuna bağlayan fosfodiester bağını fonlar.

(B) Önde gelen iplikçik üzerinde sürekli sentez:

1. Çift yönlü DNA replikasyonunda, ana iplik her bir ana iplik üzerine bir kez astarlanır.

2. Öndeki iplikçikteki RNA primeri, RNA polimeraz enzimi ile sentezlenir.

3. DNA pol III HE, önde gelen iplikçiklerin uzamasına neden olur ve son olarak DNA pol 1 ve ligaz enzimleri, geciken iplikçik halinde olduğu gibi lider iplikçiklere son bir dokunuş verir.

Ökaryotlarda DNA Replikasyonu :

Ökaryotik DNA replikasyonu, iki farklı DNA polimeraz enzimi, yani DNA polimeraz a ve DNA polimeraz requires gerektirir. DNA polimeraz δ, öncü iplikçikteki DNA'yı (sürekli DNA sentezi) sentezlerken, DNA polimeraz bir gecikme ipi üzerindeki DNA'yı sentezler (sürekli olmayan DNA sentezi). Bu iki enzimin yanı sıra, DNA replikasyonu: (1) T antijeni; (2) replikasyon faktörü A veya RF-A (ayrıca RP-A veya ökaryotik SSB olarak adlandırılır); (3) topoizomeraz I; (4) topoizomeraz II; (5) çoğalan - hücre nükleer antijeni (PCNA, ayrıca siklin de denir) ve (6) çoğaltma faktörü Cor RF-C.

Ökaryotik DNA replikasyonu işlemi aşağıdaki adımları içerir:

1. DNA sentezinin başlamasından önce, çözülmemiş DNA kompleksinin oluşumu için 8-10 dakikalık bir presetetik aşama vardır. Bu adım sadece T antijeni (T-ag veya tümör antijeni), RF-A ve topiosomeraz I ve II olmak üzere üç saflaştırılmış proteine ​​ihtiyaç duyar.

2. DNA-bağlanma alanını kullanan T-antijeni, A TP varlığında site I ve site II ile çok alt üniteli bir kompleks oluşturur ve lokal olarak gevşemeye neden olur.

3. RF-A ve T-ago Topoisomerases'in DNA sarmal bileşeninin yardımı ile bir topoizomeraz birleşimi nedeniyle daha geniş çift yönlü açılma meydana gelir, çoğaltma çatalındaki DNA topolojisini değiştirerek DNA'nın çözülmesine yardımcı olur.

4. RF-A veya SSB proteinleri, çözülmemiş tek zincirli DNA'ya bağlanır.

5. Primer RNA sentezi, örneğin DNA polimerazı ile sıkıca bağlantılı olan primaz ile gerçekleştirilir.

6. DNA polimeraz okazaki fragmanının 5 ′ ila 3 ′ yönünde sentezlenmesine yardımcı olur.

7. Replikasyon faktörü C (veya RF-C) ve PCNA (siklin), DNA polimerazlarının anahtarlanmasına yardımcı olur, böylece pol a, yerine 5. iplikçik üzerinde sürekli DNA sentezleyen pol a ile değiştirilir.

8. Daha sonra başka bir okazaki fragmanı, geciken iplikçik üzerindeki replikasyon çatalından pol a - primaz kompleksi tarafından sentezlenir ve bu adım, bütün DNA molekülü kaplanana kadar tekrar tekrar tekrarlanır.

9. RNA primerleri çıkarılır ve boşluklar prokaryotik DNA replikasyonunda olduğu gibi doldurulur.

Son zamanlarda, DNA polimeraz e'nin DNA replikasyonundaki rolü vurgulanmıştır, böylece üç DNA polimerazının (a, δ ve ε) şimdi ökaryotik DNA replikasyonunda yer aldığı bilinmektedir. A. Sugino ve arkadaşları, DNA polimerazın a'nın hem öncü hem de geciken iplikçiklerde (örneğin polimeraz a a primaz aktivitesine sahip olduğundan) işlev görebileceğini, oysaki polimeraz e ve polimeraz 5'in sırasıyla öncü ve geciktirici iplikçiklerin uzamasına dahil olduğunu öne sürdüler.

DNA Hasar ve Onarım Mekanizması

DNA Hasar Çeşitleri:

1. DNA lezyonları:

DNA'nın normal kimyasal veya fiziksel yapısındaki değişiklik, DNA lezyonları olarak adlandırılır. Kimyasallar ve radyasyon gibi birçok eksojen ajan, bazların heterosiklik halka sistemlerinde ve bazı ekzosiklik fonksiyonel gruplarda (yani bazların keto ve amino grupları) azot ve karbon atomlarının pozisyonlarında değişikliklere neden olabilir.

Bu, baz eşleşmesinin kaybına veya değişmiş baz eşleşmesine yol açabilir (örn. Değiştirilmiş bir A, T yerine C ile baz çifti olabilir). Eğer böyle bir lezyonun DNA'da kalmasına izin verilirse, DNA'da doğrudan veya dolaylı mutajenez ile bir mutasyon sabitlenebilir.

Alternatif olarak, kimyasal değişim DNA'da replikasyon ve / veya transkripsiyonu bloke ederek hücre ölümüne neden olan fiziksel bir bozulma üretebilir. Bu nedenle, DNA lezyonları mutajenik ve / veya öldürücü olabilir. Bazı lezyonlar spontandır ve DNA'nın doğal kimyasal reaktivitesi ve hücre içindeki normal, reaktif kimyasal türlerin varlığı nedeniyle oluşur.

Örneğin, baz sitozin, urasil vermek için spontan hidrolitik deaminasyona uğrar. Eğer tamir edilmezse, ortaya çıkan urasil, müteakip replikasyon sırasında aden ile bir baz çifti oluşturacak ve bir nokta mutasyonuna yol açacaktır. Depurinasyon, deoksiriboz şekerin A ve G ve C-l 'purin bazlarının N-9'u arasındaki N-glikosiliklik bağın bölünmesini ve dolayısıyla DNA'dan purin bazlarının kaybını içeren bir başka kendiliğinden hidrolitik reaksiyondur. DNA'nın şeker-fosfat omurgası bozulmadan kalır. Elde edilen apurinik bölge, purin bazlarında kodlanan bilgiler kaybedildiğinden kodlayıcı olmayan bir lezyondur.

2. Oksidatif hasar:

Bu, tüm aerobik hücrelerde, örneğin süperoksit, hidrojen peroksit ve en önemlisi hidroksil radikalinde (OH) bulunan reaktif oksijen türlerinin (ROS) mevcudiyeti nedeniyle normal koşullar altında meydana gelir. Bu radikal, DNA, I 'ye çeşitli noktalarda saldırabilir, örneğin II-oksoguanin, 2-oksoadenin ve 5-formilürasil gibi değiştirilmiş II özelliklerine sahip çeşitli oksidasyon ürünleri üretebilir. Bunların seviyeleri, iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu suyun radyolizinden hidroksil radikalleri tarafından arttırılabilir.

3. Alkilasyon:

Alkile edici maddeler, normal metilleme enzimleriyle metillenmiş olanlardan farklı olarak nükleik asitler üzerindeki çeşitli pozisyonlara kolayca alkil (örneğin metil) grupları ekleyen elektrofilik kimyasallardır. Yaygın örnekler metilmetan sülfonat (MMS) ve etilnitrosoüredir (ENU).

Metillenmiş bazların tipik örnekleri, 7-metilguanin, 3-metil-adenin, 3-metilguanin ve 0-6-metilguanindir. Bu lezyonların bazıları, replikasyon ve transkripsiyon sırasında DNA'nın gevşemesine müdahale edebildiklerinden potansiyel olarak öldürücüdür. Çoğu da dolaylı olarak mutajeniktir; bununla birlikte, 0-6-metiljuanin, replikasyon sırasında timin ile baz çiftleşebileceğinden doğrudan bir mutajenik lezyondur.

4. hantal ekler:

Siklobütan pirimidin dimerleri, bir siklobütan halkası vermek üzere her bir bazın bitişik pirimidinlerinden ultraviyole ışıkla, her bir bazın iki bağlı C5 ve C6 karbon atomlarının siklizasyonu ile oluşturulur. Sonuçta karşıt iplikçik ile baz eşleşmesinin ortaya çıkması, DNA'nın lokal denatürasyonuna neden olur ve çoğaltma ve transkripsiyonu bozabilecek hacimli bir lezyon oluşturur. Başka bir pirimidin dimer türü olan 6, 4-foto ürünü, bir pirimidin bazının C6'sı ile bitişik bazın C4'ü arasında bir bağ oluşmasından kaynaklanır.

Kömür katranı kanserojen benzo [a] piren karaciğerde sitokrom P-450 ile metabolize edildiğinde, metabolitlerinden biri (bir diol epoksit) kovalent olarak 2-amino guan artıkları grubuna bağlanabilir. Diğer birçok aromatik arilleme maddesi, DNA ile kovalent katkılar oluşturur. Karaciğer kanserojen aflatoksin B de kovalent olarak DNA'ya bağlanır.

DNA Onarımı:

Onarım sistemleri, hareketi başlatmak için DNA'daki çeşitli değişiklikleri tanır. Bir hücrenin DNA hasarı ile başa çıkmak için birkaç sistemi olabilir. Bu sistemler aşağıdakileri içerir: (1) Doğrudan onarım, (2) Eksizyon onarımı (3) Uyumsuzluk onarımı, (4) Toleranslı sistemler ve (5) Alma sistemleri.

1. Doğrudan tamir:

DNA hasarının tersine çevrilmesi veya basit bir şekilde çıkarılması, doğrudan onarım, örneğin, timin dimerlerinin oluşumuna katılan iki timin kalıntısının iki 4 ve iki karbonu arasındaki kovalent bağların çıkarılması olarak bilinir.

Timin dimerleri genellikle UV ışıması nedeniyle oluşur ve replikasyon ve transkripsiyona müdahale eder. Kelner (1949), çok sayıda bakteri yüksek dozlarda UV radyasyonuna dayanabileceğini gözlemlemiştir; yoğun bir görünür ışık kaynağına maruz kaldıklarında.

Bu fenomene fotoktivasyon denir. UV ışıması sırasında belirli bir enzimin bakteriyel DNA'ya seçici olarak bağlandığı gösterilmiştir. Foto-aktifleştirme işlemi sırasında, enzim görünür ışık tarafından aktive edilir. Timin dimerlerini ayırır, böylece onları orijinal hallerine geri getirir. Bu onarım işlemi enzim aracılı ve ışığa bağımlıdır.

2. Eksizyon onarımı:

Bu onarım mekanizmasında, DNA zincirinin hasar görmüş veya değiştirilmiş segmenti eksize edilir ve yerinde yeni bir DNA yaması sentezlenir. Eksizyon onarım sistemleri spesifikliklerine göre değişmekle birlikte, ana yol aşağıdaki üç adımı içerir:

(i) Tanıma ve İnsizyon:

Bir DNA zincirinin hasarlı / değiştirilmiş bölümü bir endonükleaz tarafından tanınır; bu enzim daha sonra etkilenen şeridi hasarın her iki tarafında da keser.

(ii) Çıkarma:

Bir 5 ′ -> 3 ′ eksonükleaz (DNA polimeraz I) hasarlı / değiştirilmiş kısmı sindirir; Bu, DNA çift sarmalında tek iplikli bir bölge oluşturur.

(iii) Sentez:

Bu adımda, eksizyon tarafından üretilen tek iplikli bölge, eksize edilen segment için replasmanı sentezleyen bir DNA polimerazı için bir şablon görevi görür. DNA ligazı daha sonra eksize edilmiş bölüm için replasman sentezinden sonra kalan nicki kapatır.

E. coli'de eksizyon büyük olasılıkla DNA polimeraz I'in 3 -> 5 ′ eksonükleaz aktivitesinden kaynaklanırken sentez, aynı enzimin 5 ′ -> 3 ′ polimeraz aktivitesi ile gerçekleştirilir. Eksizyon onarım sistemleri hem prokaryotlarda hem de ökaryotlarda oldukça yaygındır. Bu sistemlerin bazıları, DNA'ya verilen genel hasarı tanır, diğerleri ise çok spesifiktir; örneğin, AP endonükleazları, riboz artıklarını depurinasyon bölgelerinden uzaklaştırır. Eksizyon onarımı farklı uzunluklarda DNA içerir ve aşağıdaki üç sınıfa ayrılır:

(a) Çok kısa yama onarımı (VSP):

Bu sistem belirli bazlar arasındaki uyumsuzlukların onarımı ile ilgilidir.

(b) Kısa yama onarımı:

Bu sistemde yaklaşık 20 baz uzunluğunda DNA zinciri eksize edilir ve hasarlar bir tamir endonükleazın bileşenlerini kodlayan uvr genleri (uvr, A, B, C, E.coli'nin) ile onarılır. Helisaz aktivitesi için başka bir enzim uvr D de gereklidir.

(c) Uzun yama onarımı:

Bu sistem yaklaşık 1500 baz uzunluğun eksizyonunu içerir, ancak bazen eksize edilmiş segment> 9000 baz olabilir. Çok daha az yaygındır ve replikasyonu engelleyen hasara neden olması gerekir. E. coli'de bu sistem ayrıca uvr genlerini ve DNA polimeraz I'yi de içerir.

3. Uyumsuzluk Onarımı:

Uyumsuzlukların düzeltilmesini veya tamamlayıcı olmayan tabanlar arasında eşleşmeyi içerir. Yanlış eşleşmeler (a) replikasyon sırasında veya (b) baz değişimlerinden (örneğin, sitozinin urasile deaminasyonundan) kaynaklanabilir ve DNA'nın çift sarmalında yapısal bozulmalara neden olabilir. Bu değişimler E. coli'de aşağıda açıklanan çok kısa yama eksizyon onarım sistemi tarafından gerçekleştirilir.

E. coli'de Uyumsuzluk Onarım Sistemi:

GC -> GT'deki gibi bir baz çiftinde bir uyumsuzluk olduğunda, teorik olarak ya vahşi tipe (GC) ya da bir mutant tipine (AT) yol açmak için tamir edebilir. Bu nedenle, tamir sistemi eski ve yeni iplikler arasında ayrım yapmalı ve vahşi tipin eski haline getirilmesi için sadece yeni ipliği onarmalıdır.

Bu çok kısa yama eksizyon onarım sistemi ile yapılır ve sırasıyla E. coli'de kodlanan Mut L, Mut S, Mut U ve Mut H olmak üzere dört protein gerektirir; bunlar sırasıyla mut L, mut S, mut U ve mut H genleridir. Replikasyon sırasında üretilen baraj onarım sistemi ile düzeltilir.

E. coli'nin gen barajı, her iki DNA şeridinde GATC dizisinin adenini ile metilat yapan bir metilaz üretir. Tamamen metillenmiş bir GATC dizisinin replikasyonu, yeni sentezlenmiş tellerdeki A tortularının metillenmemiş olduğu bir hemimetillenmiş dizi verir.

Bu hedef dizinin metillenmemiş hali, yeni ipliği tanımlamak için kullanılır; yeni iplikçikteki uyumsuzluk bölgesi etrafındaki bazlar eksize edilir ve bir değiştirme sentezlenir. Sistem mut L, mut S, mut H ve uvr D genlerinin ürünlerini içerir.

Alma Sistemleri Onarımı:

Bu sistemler aynı zamanda 'replikasyon sonrası onarım' veya 'rekombinasyon onarımı' olarak da bilinir. E.coli'de bu tamir sistemi, Rec A proteinini üreten rec A genine dayanmaktadır. Rec A proteini, genetik rekombinasyon sırasında DNA molekülleri arasındaki iplik alışverişinde ve ayrıca rekombinasyon onarımı sırasında tek iplikçik değişiminde işlev görür. Biri rec B, C genleri ve diğeri rec F'yi içeren iki rec A yolu vardır.

Bu onarım sistemi, yapısal bir bozulma hasarlı bölgede çoğaltmayı engellediğinde çalışır. Örneğin, eksizyon onarımında eksik olan E. coli mutantları, timin dimerlerini gideremeyecektir. Böyle bir durumda, çoğaltma normalde hasarlı bölgelere doğru ilerler; DNA polimeraz, etkilenen zincirin replikasyonunu durdurur ve hasarlı bölgeden geçerek replikasyonu yeniden başlatır.

Tamamlayıcı iplikçik normal olarak diğer iplikçikteki hasarlı bölgede çoğaltılır. Bu nedenle replikasyon, bir normal DNA molekülü soyunu ve bir iplikçikte timin dimer içeren bir molekül ve tamamlayıcı iplikçikte uzun bir boşluk verir. Timin dimer içeren soy DNA molekülü, aralarındaki boşluklardan bir tanesini doldurmak suretiyle onarılmadıkça kaybolur.

Bu, iki soy DNA molekülü arasındaki tek iplikçik değişimi yoluyla sağlanır; değişim bölgesi boşluğu doldurur ve Rec A proteini tarafından indüklenir. Bu değişimin bir sonucu olarak, normal soy molekülü, bir boşluk olan bir tek iplikli bölgeye sahiptir. Bu boşluk DNA sentezi ile tamir edilir.

Tolerans Sistemi:

Bu sistemler, muhtemelen hasarlı bölgelerin yüksek oranda hatayla çoğaltılmasına izin verilerek hasarlı bölgede normal çoğaltmayı engelleyen hasarlarla ilgilidir. Bu sistemler, genom büyüklüğünün çok büyük olduğu ökaryotlarda özellikle önemli olabilir ve bu nedenle hasarın tamamen onarılması pek olası değildir.