Bir Bakterinin Amino Asit Triptofanı Hidrolize Etme Yeteneğini Bulmak İçin Dole Testinde (Şekil İle)

Bir Bakterinin Amino Asit Triptofanı Hidrolize Etme Yeteneğini Bulmak İçin Dole Testinde!

Prensip:

Bazı bakteriler, 'triptofanaz' enzimini üretebildikleri için, amino asit triptofanı indole hidrolize etme kabiliyetine sahiptir.

Triptofan, indol, piruvik asit ve amonyak üretimi ile hidrolize edilir. İndol, pembe bir halka üreten renk reaktifi, paradimetilaminobenzaldehit (p-DMAB, yani Kovac'ın reaktifi) tarafından tespit edilir. İndol, p-DMAB ile reaksiyona girerek, pembe renkli olan kinoidal kırmızı menekşe bileşiğini (rosindol boya) 'üretmektedir. Reaktif amil alkolde hazırlandığı için halka yüzeyde üretilir.

İndol testinde, test bakterileri, triptofan içeren bir et suyu ortamında büyütülür. Bakterilerin triptofanı indole hidrolize etme kabiliyetleri varsa, p-DMAB ilavesi üzerine et suyu kültürünün yüzeyinde pembe bir halka oluşur.

Gerekli malzemeler:

Test tüpleri, konik şişesi, pamuk tıkaçları, aşılama döngüsü, otoklav, bunsen brülörü, laminer akış odası, atma kavanoz, kuluçka makinesi, tripton suyu, Kovac reaktifi (paradimetilaminobenzaldehit), izole koloniler veya saf bakteri kültürleri.

Prosedür:

1. Tripton et suyu besiyeri veya 100 ml et suyu için gereken hazır tozun içerikleri tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 250 ml'lik bir konik şişede 100 ml damıtılmış su içinde çözülür. Tripton, bir triptofan kaynağı olarak işlev görür. Bu nedenle, suya triptofan ilavesi isteğe bağlıdır (Şekil 7.3).

2. pH değeri, bir pH kağıdı veya pH ölçer kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HC1 kullanılarak 7.5 veya daha düşükse 0.1 N NaOH kullanılarak 7.5'e ayarlanır. Şişe, gerekirse bileşenleri tamamen çözmek için ısıtılır.

3. Et suyu beş adet test tüpüne (yaklaşık olarak her biri 5 mi) dağıtılır, pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanır.

4. Et suyu tüpleri 121 ° C'de (15 psi basınç) 15 dakika otoklavda sterilize edilir.

5. Et suyu tüplerinin oda sıcaklığına soğumasına izin verilir.

6. Test bakterileri, aseptik olarak, tercihen bir laminer akış odasında, bunsen alevinde sterilize edilmiş bir aşılama döngüsünün yardımı ile et suyuna aşılanır. Her aşılamadan sonra döngü sterilize edilir.

7. Aşılanmış et suyu tüpleri, bir inkübatörde 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.

8. Renk reaktifi, para-dimetilaminobenzaldehit (p-DMAB) (yani Kovac'ın reaktifi) et suyu tüplerine (her biri 0.5 mi) bırakılır ve 1 dakika sonra gözlenir.

Alternatif:

7. Oksalik aside batırılmış kağıt şeritleri aşılanmış et suyu tüplerinin ağzına yerleştirilir, böylece kağıt şeritlerinin yaklaşık yarısı et suyu ile temas etmeden tüplerin içinde kalır ve diğer yarısı dışarıda kalır. Bunun için, filtre kağıdı yaklaşık 35 mm uzunluğunda ve 5 mm genişliğinde şeritler halinde kesilir. Şeritler, sıcak doymuş sulu bir oksalik asit çözeltisine batırılır ve kullanımdan önce kurutulur.

8. Aşılanmış çorba tüpleri, bir inkübatörde 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.