Bir Bakteriyofaj Üretmek ve Numaralandırmak için Deney
Bir Bakteriyofaj Üretmek ve Numaralandırmak İçin Deney Yapın!
Prensip:
Bir bakteriyofaj'a (bakterileri enfekte eden virüs) duyarlı bir bakteri süspansiyonu, bu bakteriyofaj ile tohumlanır ve bir agar plakasında bir birleştirme çiminde büyümeye bırakılır.
Bakteriyofaj partikülleri bakteri hücrelerinde büyür ve onları lize eder. Bakteri hücrelerinin parçalanması, bakteri birleşik çimlerinde açık bölgelerin oluşmasına neden olur. Bu açık bölgelere 'plak' denir. Her bir temiz bölgenin, tek bir bakteriyofaj partikülü tarafından oluştuğu kabul edilir. Bu nedenle, plak oluşturma birimlerinin (PFU) sayısı, bakteriyofajın sayısını temsil eder.
Seri seyreltme tekniği, bakterilerin sayımında kullanılana benzer bakteriyofajların sayımında kullanılır. Bir numunede bulunan faj partiküllerinin sayısı, tohumlanmış agar plaka üzerinde oluşturulan plakların sayısının sayılması ve bunun seyreltme faktörü ile çarpılmasıyla belirlenir.
Geçerli bir faj sayısını belirlemek için, plaka başına plak sayısı 300'ü geçmemeli veya 30'dan az olmamalıdır. 300 PFU'dan büyük olan plakalar 'sayılmayacak kadar çok sayıda' (TNTC) olarak adlandırılırken, 30 PFU'dan az gösteren plakalar 'sayılacak çok az' (TFTC).
Gerekli malzemeler:
Tripton suyu, tripton yumuşak ağarı, tripton sert ağarı, konik şişesi, test tüpleri, sterilize petri kapları, pamuk tıkaçları, bakteriyofaj stok kültürü (Örn: T2 coliphage), bakterilerin besleyici kültürü (Örn: Escherichia coli B), sterilize pipetler, otoklav, sıcak su banyosu, bunsen burner, laminer akış haznesi, imha kavanoz, kuluçka makinesi.
Prosedür:
1. On beş pipet (paslanmaz çelik pipet kasasında) ve beş petri tabağı sıcak hava fırınında 180 ° C'de 3 saat boyunca sterilize edilir. Alternatif olarak, bunlar kraft kağıdı ile kaplanabilir, iplik veya lastik bant ile bağlanabilir ve ortamla birlikte bir otoklavda sterilize edilebilir (Şekil 8.3).
2. 100 ml et suyu için gerekli olan tripton et suyu besiyerinin veya hazır tozunun muhtevası tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 250 ml'lik bir konik balon içinde 100 ml damıtılmış su içinde çözülür. PH, gerektiği şekilde 0.1 N HCI veya 0.1 N NaOH kullanılarak 7.5'e ayarlanır. Şişe, gerekirse bileşenleri tamamen çözmek için ısıtılır.
3. Et suyu, 10'lu test tüpüne (her biri 9 ml) dağıtılmış, pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.
4. 100 ml ortam için gerekli olan tripton yumuşak agar besiyerinin veya hazır tozunun muhtevası tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 250 ml'lik bir konik balon içinde 100 ml damıtılmış su içinde çözülür. PH, gerektiği şekilde 0.1 N HCI veya 0.1 N NaOH kullanılarak 7.5'e ayarlanır. Şişe, agarı besiyerinde tamamen çözmek için ısıtılır.
5. Bu sıvı besiyeri 5 adet test tüpüne (her biri 2 mi), pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.
6. Tripton sert agar besiyerinin içerikleri veya 100 ml besiyeri için gereken hazır tozu tartılır ve pH 7, 5'e ayarlandıktan sonra ısıtılarak 250 ml'lik bir konik şişede 100 ml damıtılmış su içinde çözülür. Şişe pamukla tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.
7. 10 tripton broth tüpü, 5 tripton yumuşak agar tüpü ve tripton sert agar ortamı içeren şişe, otoklavda 15 dakika boyunca 121 ° C'de (15 psi basınç) sterilize edilir.
8. Konik şişedeki steril tripan sert agar ortamı, 5 tripan sert agar plakası elde etmek için aseptik olarak 5 sterilize edilmiş petri kabına dökülür.
9. Bakteriyofajın stok kültürünün bir ml'si (Örn: T2 coliphage), sterilize edilmiş bir pipet kullanılarak, tercihen bir laminer akış odasında, bir tripton et suyu tüpüne (9 mi) aseptik olarak aktarılır. Bu, 10 kez seyreltme olur (yani, 10-1 ). Bu, 10 ila 10'luk bir nihai seyreltme elde etmek için aseptik olarak seri olarak diğer dokuz broth tüpüne seyreltilir (Şekil 8.4).
10. 5 sterilize edilmiş tripton yumuşak agar tüpü alınır ve agarın erimesi için bir su banyosunda 100 ° C'ye ısıtılır. Tüpler soğutulur ve erimiş yumuşak yumuşak tüpler 45 ° C'de tutulur.
11. Farklı konsantrasyonlarda faj içeren yukarıdaki 10 tüp arasından beş tüp (yani, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 ve 10-9 ) seçilir. Bu tüplerden aseptik olarak 1 ml, ayrı sterilize edilmiş pipetler kullanılarak beş tripton yumuşak agar tüpüne aktarılır.
12. Bakterilerin iki damla besin broth kültürü (Örn: Escherichia coli B), beş farklı konsantrasyonda bakteriyofaj içeren her tripton yumuşak agar tüpüne tercihen bir laminer akış odasında, aseptik olarak aktarılır ( 10-5 ila 10 -9) ).
13. Bakteriyofaj ve bakterileri içeren beş tripton yumuşak agar tüpünün içeriği, ellerin avuçlarının arasında döndürülerek hızla karıştırılır.
14. İçerikler, 10 ila 5 ila 10 ila 9 etiketli beş triptoton sert agar plakasına aseptik olarak dökülür, böylece bir çift katmanlı plaka kültür hazırlığı oluşturulur. Plakalar hafifçe döndürülmüş ve sertleşmiştir.
15. Plakalar, bir inkübatörde, 37 ° C'de ters pozisyonda inkübe edilir.
Gözlemler:
1. Tüm plakalar, bakteri çimlerinde açık alanlar olarak gelişen plak oluşturma birimleri (PFU'lar) için gözlenir.
2. Sadece 30 ila 300 arasında PFU'lara sahip olan plakalar, faj sayımı için dikkate alınır. Her plakadaki PFU sayısı sayılır. 300 PFU'dan daha büyük olan plakalar 'sayılmayacak kadar çok sayıda' (TNTC), 30 PFU'dan daha az gösteren plakalar 'sayılacak çok az' (TFTC) olarak belirlenmiştir. Bu plakalar dikkate alınmamıştır.
3. Gözlemlere dayanarak, stok faj kültürünün ml başına düşen bakteriyofaj sayısı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır.
Faj sayısı / ml = PFU sayısı X seyreltme faktörü
Örneğin, PFU'ların sayısı 10-7'lik bir seyreltmede 280 ise, fajın stok kültüründeki faj sayısı 280 X 106 faj / ml'dir (= 2.80 X10 faj / ml).
