Virüsün Kolipajını İzole Etme Deneyi (diyagramla)

Virüsün Kolipajını İzolasyon Etmek İçin Deneyin!

Prensip:

Bakterileri enfekte eden bakteriyofaj veya faj (virüs) Escherichia coli'ye colifaj (coli: E. coli-, faj: bakteriyofaj) adı verilir.

Toprak, dışkı maddesi ve işlenmemiş kanalizasyon gibi çeşitli doğal kaynaklardan elde edilebilir. Düşük konsantrasyonda bulunduğu için bu kaynaklardan izolasyonu kolay değildir.

Bu nedenle, ilk sayısı, hücre içi bakteri bakımından zengin bir kültürün (yani, E. coli) kolipaj içeren numuneye ilave edildiği ve inkübe edildiği zenginleştirme aşaması ile arttırılır. Coliphage, E. coli'yi enfekte eder ve sayıca bol miktarda artar. Bu coliphage bakımından zengin kültür, partiküllü maddeyi çözmek için santrifüjlenir.

Tortu atılır ve süpernatan, bakteri ve diğer parçacıkları tutmak için mikrobiyal filtreden süzülür ve kolipajın geçmesine izin verilir. Colhahage bakımından zengin olan süzüntü, E. coli'nin bir süspansiyonunu tohumlamak için kullanılır; bu daha sonra bir agar plakasında bir birleştirme çiminde büyümeye bırakılır.

Kolipaj, E. coli hücrelerinin içinde büyür ve onları lize eder. Bakteri hücrelerinin parçalanması, bakteri birleşik çimlerinde açık bölgelerin oluşmasına neden olur. Bu açık bölgelere plak denir. Her bir temiz alanın, tek bir colifhage tarafından oluşturulduğu varsayılmaktadır.

Gerekli malzemeler:

Pipetler, konik şişeler, petri kapları, test tüpleri, pamuk tıkaçları, bunsen burner, atma kavanozlar, santrifüj, membran filtrasyon aparatı, laminer akış haznesi, otoklav, kuluçka makinesi, bakteri yemi suyu, tripton yumuşak agar, tripton sert agar, besiyerinin besi suyu kültürü bakteri Escherichia coli (örneğin, E. coli B), numune (örneğin, ham lağım suyu).

Prosedür:

1. Beş pipet (paslanmaz çelik pipet kasasında) ve beş petri tabağı sıcak hava fırınında 180 ° C'de 3 saat boyunca sterilize edilir. Alternatif olarak, bunlar kraft kağıdı ile kaplanabilir, iplik veya lastik bant ile bağlanabilir ve ortamla birlikte bir otoklavda sterilize edilebilir (Şekil 8.5).

2. 100 ml ortam için gerekli olan bakteriyofaj et suyu besiyerinin veya hazır tozunun içerikleri tartılır, 250 ml'lik bir konik şişede 100 ml damıtılmış su içinde çözülür ve pH 7.6'ya ayarlanır. Şişe pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

3. Tripton yumuşak agar besiyerinin veya 100 ml besiyeri için gereken hazır tozunun muhtevası tartılır, 100 ml damıtılmış su içinde 250 ml konik bir şişe içinde eritilir ve pH 7, 5'e ayarlanır.

4. Bu sıvı besiyeri 5 adet test tüpüne (her biri 2 mi), pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

5. Tripton sert agar besiyerinin içerikleri veya 100 ml besiyeri için gereken hazır tozu tartılır ve pH 7, 5'e ayarlandıktan sonra ısıtılarak 250 ml'lik bir konik şişede 100 ml damıtılmış su içinde çözülür. Şişe pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

6. Bakteriyofaj suyu, 5 tripton yumuşak agar tüplerini içeren şişeye, tripton sert agar ortamına sahip şişeye ve boş pamuk tıkalı 250 ml konik bir şişeye sahip şişeye, otoklavda 15 dakika boyunca 121 ° C'de (15 psi basınç) sterilize edilir.

7. Konik şişedeki sterilize edilmiş tripton sert agar ortamı, 5 sterilize edilmiş petri tabağına aseptik olarak dökülür ve 5 triptoton sert agar plakası elde etmek üzere soğumaya bırakılır.

8. Pamukla takılmış sterilize edilmiş boş 250 ml konik şişeye, 5 ml sterilize edilmiş bakteriyofaj et suyu, 5 ml E. coli B et suyu kültürü ve 45 ml ham lağım suyu aseptik olarak, tercihen bir laminar akış odasına aktarılır (Şekil 8.6). .

9. Şişeye, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir, böylece kanalizasyondaki kolipajın konakçı bakteri hücreleri (E. coli B hücreleri) içinde çoğalmasına izin verilir.

10. Şişenin içeriği, 100 ml'lik santrifüj tüplerine dökülür ve partikülleri çöktürmek için 2500 rpm'de 20 dakika boyunca bir santrifüjde santrifüjlenir. Tortu atılır.

11. Kofaj bakımından zengin olan süpernatan, bir membran filtrasyon aparatı içinden filtre edilir. Kalıntı atılır.

12. Beş sterilize edilmiş tripton yumuşak agar tüpü alınır ve agarın erimesi için bir su banyosunda 100 ° C'ye ısıtılır. Tüpler soğutulur ve bir su banyosunda 45 ° C'de tutulur.

13. Steril bir pipet kullanılarak, 1, 2, 3, 4 ve 5 damla bakteri içermeyen filtrattan, coliphage bakımından zengin, aseptik olarak beş tripton yumuşak agar tüpüne aktarılır.

14. Her bir tripton yumuşak agar tüpüne, 0.1 ml Escherichia coli B'nin bir besin broth kültürü aseptik olarak aktarılır.

15. Virüs, kolipaj ve bakterilere sahip beş tripton yumuşak agar tüpünün içeriği, E. coli B, tüplerin ellerin avuçlarının arasında döndürülmesiyle hızla karıştırılır.

16. İçindekiler beş tripton sert agar plakasına (1 ila 5 damla etiketli) dökülür, böylece bir çift katmanlı plaka kültür hazırlığı oluşturulur. Plakalar hafifçe döndürülmüş ve sertleşmiştir.

17. Aşılanan plakalar, bir inkübatörde 24 saat boyunca 37 ° C'de ters bir pozisyonda inkübe edilir.

Gözlemler:

1. Tüm plakalar, bakteri çimlerinde açık alanlar olarak gelişen plak oluşturma birimleri (PFU'lar) için gözlenir. Plak oluşumu kültürde kolipaj varlığının bir göstergesidir.

2. Her plak, izole edilmiş coliphage'ın zengin bir gelişimini temsil eder.

3. Plakların sayısı bütün plakalarda sayılmakta ve aşağıdaki gibi sıralanmaktadır (Tablo 8.1).

Tablo 8.1: Kollajen sayısının gözlemleri :