Hidrolize Edilme Yeteneklerini Bulmak İçin Bakteriler Üzerinde Orto-Nitrofenil Galaktosid Testi Orto-Nitrofenil-PD-Galaktoside

Hidroliz Orto-Nitrofenil-PD-Galaktoside Yeteneklerini Bulmak İçin Bakterilerde Orto-Nitrofenil Galaktosid Testinin performansını öğrenmek için bu makaleyi okuyun!

Prensip:

Bazı bakteriler laktoz fermente etme kabiliyetine sahiptir. Bunlara 'laktoz fermente edici bakteriler' veya 'laktoz-fomenterler' denir.

Laktozu fermente edemeyenlere laktoz fermente olmayan bakteri 'veya' laktoz-olmayan bakteri 'denir.

Laktoz fermente edici bakteriler, laktoz fermantasyonunda rol alan 'permeaz' ve 'β-galaktosidaz' gibi iki enzim üretebilir. Permeaz, laktozun bakteri hücrelerine girmesine yardımcı olurken, β-galaktosidaz, laktozu glikoza ve galaktoza hidrolize ederken, β-galaktosidaz, bakteri hücrelerinin ortamında laktoz mevcudiyeti tarafından indüklenen hücre içi indüklenebilir bir enzimdir.

Laktoz fermente edici bakteriler hem perm-galaktosidaz hem de permeaz üretebilirken, laktoz fermente etmeyen bakteriler permeaz üretemez, ancak β-galaktosidaz üretebilir veya üretmeyebilir. ONPG testi, laktoz-fermente olmayan bakterilerin β-galaktosidaz üretme kabiliyetini bulmak için yapılır.

Bunun için, laktoz fermente etmeyen bakteri hücrelerinin hücre zarı, eğer varsa, P-galaktosidaz dahil olmak üzere tüm hücre içi enzimleri serbest bırakmak için toluen eklenerek eritilir. Β-galaktosidaz enzimi, substrat orto-nitrofenil-β-D-galtositozu (ONPG) hidrolize eder, orto-nitrofenol, renkli sarıdır.

Orto-nitrofenil galaktosit testinde (ONPG testi) test bakterileri, laktoz içeren üçlü şeker demir ağar (TSI agar) meyvelerinde büyütülür. Bakteriler bir laktoz-fermente edilmemişse, kırmızı popo ve kırmızı eğik ile gösterildiği gibi, tuzlu bir bakteri süspansiyonu yapılır, bunlara toluen ve ardından ONPG çözeltisi ilave edilir. Bakteriler P-galaktosidaz enzimi üretme yeteneğine sahipse, bakteri süspansiyonunun rengi sarıya döner.

Gerekli malzemeler:

Test tüpleri, konik şişesi, pamuk tıkaçları, aşılama döngüsü, aşılama iğnesi, otoklav, bunsen burner, laminer akış haznesi, atma kavanoz, kuluçka makinesi, TSI agar, toluen, o-nitrofenil-β-D-galaktosid (ONPG) çözeltisi, izole koloniler veya saf bakteri kültürleri.

Prosedür:

1. TSI agar besiyerinin içerikleri (ana bileşenleri olarak 3 şekeri ve demiri içeren) veya 100 ml besiyeri için gereken hazır tozu tartılarak 100 ml damıtılmış su içinde 250 ml'lik bir konik şişe içinde tartılır ve eritilir. Çalkalama ve döndürme (Şekil 7.16).

2. pH değeri, bir pH kağıdı veya pH ölçer kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HCI kullanılarak veya daha azsa 0.1N NaOH kullanılarak 7.4'e ayarlanır.

3. Şişe, agarı ortam içinde tamamen çözmek için ısıtılır.

4. Katılaşmadan önce, sıcak erimiş haldeki ortam 5 test tüpüne (her biri yaklaşık 20 mi) dağıtılır.

5. Test tüpleri koton tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

6. Bir otoklavda 121 ° C'de (15 psi basınç) 15 dakika sterilize edilirler.

7. Sterilizasyon sonrasında, otoklavdan çıkarılır ve ortamın soğutulması ve katılaştırılması için TSI agar slantlarının elde edilmesi için meyilli bir pozisyonda tutulur.

8. Test bakterileri, aseptik olarak, tercihen laminer bir akış odasında, alın içine bıçaklanarak ve alevle sterilize edilmiş bir iğne yardımı ile çekiklerin yüzeyinde çizik yapılarak eğiklere aşılanır. İğne her aşılamadan sonra sterilize edilir.

9. Aşılanan slantlar, bir inkübatörde 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.

10. Bakteri bir laktoz fermentörü ise, ONPG testi için seçilmez. Bakteriler laktoz fermente ediciyse, kırmızı alın ve kırmızı eğik ile gösterildiği gibi, ONPG testi için seçilir.

11. 0.25 ml tuzlu su içeren bir test tüpüne, bakterilerin kalın bir süspansiyonunu oluşturmak üzere, alevle sterilize edilmiş bir ilmek vasıtasıyla kalın bir bakteri kültürü konur.

12. Bir damla toluen eklenir, karıştırılır ve 5 dakika 37 ° C'de inkübe edilir.

13. O-nitrofenil galaktosid çözeltisi (ONPG çözeltisi) eklenir ve 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir. Sonra renk değişimi gözlenir. Yine 24 saat sonra renk değişimi gözlemlenir.