Azaltılmış Sitokrom C'yi Oksitleme Yeteneğini Bulmak İçin Bakterilerde Oksidaz Testi

Azaltılmış Sitokrom C'yi Oksitleme Yeteneklerini Bulmak İçin Bakterilerdeki oksidaz testi hakkında bilgi edinmek için bu makaleyi okuyun:

Prensip:

Bazı bakteriler, hücrelerinde bulunan 'indirgenmiş sitokrom C'yi' okside etme kabiliyetine sahiptir, çünkü 'sitokrom oksidaz' enzimini üretebilirler.

Oksitlenmiş sitokrom C, boya N-tetrametil-para-fenilendiamin (yani oksidaz reaktifi) ile mor renk (Wurster'ın moru) üretir.

Oksidaz testinde, test bakterilerinin kolonilerini içeren besin agar plakaları oksidaz reaktif çözeltisi ile sulandırılmıştır. Bakterilerin sitokrom oksidaz enzimi üretme kabiliyetleri varsa, plakalardaki kolonilerin rengi maviye döner. Bakteriler sitokrom oksidaz üretme yeteneğine sahip değilse, koloniler oksidaz reaktifinin orijinal pembe rengini korur.

Gerekli malzemeler:

Petri kapları, konik şişesi, pamuk tıkaçları, platin tel aşılama halkası, otoklav, bunsen brülör, laminer akış haznesi, atma kavanoz, kuluçka makinesi, Whatman filtre kağıdı şeridi, oksidaz reaktif maddesi (N-tetrametil-para-fenilendiamin) besleyici agar, izole koloniler veya saf bakteri kültürleri.

Prosedür:

(a) Plaka Yöntemi:

1. İki petri kabı temizlenir, kağıtla kaplanır ve iplik veya lastik bantla bağlanır (Şekil 7.19). Bu aşamalar ve 6. adımda petri kaplarının sterilizasyonu, eğer fırında sterilize edilmiş petri kapları doğrudan kullanılıyorsa, atlanır.

2. 100 ml ortam için gerekli olan besin maddesi agar ortamının veya hazır tozunun içerikleri tartılır ve çalkalanarak ve döndürülerek 250 ml'lik bir konik balon içinde 100 ml damıtılmış su içinde çözülür.

3. pH değeri bir pH kağıdı veya pH ölçer kullanılarak belirlenir ve daha fazla ise 0.1N HCI kullanılarak 7.0'a veya daha az ise 0.1 N NaOH kullanılarak 7.0'a ayarlanır.

4. Şişe, agarı ortam içinde tamamen çözmek için ısıtılır.

5. Şişe pamuk tıkalı, kraft kağıtla kaplı ve iplik veya lastik bant ile bağlanmış.

6. İki petri kabı ve besin agar ortamı içeren konik şişesi, bir otoklavda 15 dakika boyunca 121 ° C'de (15 psi basınç) sterilize edilir.

7. Sterilizasyondan sonra, otoklavdan çıkarılır ve ortamın katılaşmasına izin vermeden bir süre soğumaya bırakılır. Ortamın soğutulması plakaların içinde su damlacıklarının yoğunlaşmasını ve birikmesini önler. Ortam, depolama sırasında önceden hazırlanmış ve katılaşmışsa, tamamen eriyene kadar dikkatlice ısıtılarak sıvılaştırılmalıdır.

8. Besleyici agar plakaları hazırlamak için, sterilize edilmiş besleyici agar ortamı soğumadan ve katılaşmadan önce, ılık ve ılık bir halde, aseptik olarak, tercihen bir laminer akış odasının içine, iki sterilize edilmiş petri kabına (her biri yaklaşık 20 ml) dökülür. erimiş ortam, petri kabının tabanını tamamen kaplar.

Sonra, plakalar kapaklarıyla kapatılır ve içindeki ortamı katılaştırmak için soğumaya bırakılır. Plakaların ve kapakların iç yüzeyinde yoğunlaşabilen su buharı, plakaları ve kapaklarını bir inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık 1 saat süreyle ters konumda tutularak buharlaştırılır.

9. Her plaka alt tarafta dörtte üçü olarak işaretlenmiştir.

10. Test bakterilerinin "spot inokülasyonu", alevle sterilize edilmiş bir ilmek yardımı ile bakterilerin bir spotunu (veya küçük bir lekesini) yaparak, her çeyrek ortasına aseptik olarak, tercihen laminer bir akış odasında, her çeyrek merkezinde yapılır. Her aşılamadan sonra döngü sterilize edilir.

11. Aşılanmış plakalar, bakteri kolonileri görülene kadar 24 saat boyunca 37 ° C'de 24 saat boyunca bir inkübatörde ters konumda, yukarıdan aşağı inkübe edilir.

12. Plakalar oksidaz reaktifi ile sulandırıldı.

(b) Kağıt Yöntemi:

1.% 1 oksidaz reaktifine batırılmış bir Whatman filtre kağıdı şeridi kurutulur ve karanlıkta tutulur.

2. Kullanmadan önce nemlendirilir ve bir test telinin bir halkası, bir platin tel halkasının yardımıyla üzerine bir nokta olarak konur. Nikrom döngü reaktifi oksitleyebilir. Bu nedenle, platin döngü kullanılmalıdır.

3. Nokta 10 saniye sonra gözlenir.