Genom Dizileme Sebepleri ve Metodolojileri

Genom dizilimi karmaşık, karmaşık ve özel teknoloji gerektirir. 500-800 bp'lik bir segment sıralanabilir. Bununla birlikte genomlar çok büyüktür, örneğin insanlar için 4.2 x 106 bp ve 3.2 x 106 bp ile E. coli.

Bu nedenle küçük segmentleri sıralamak için gereklidir. Bu tür bölümler, genomik DNA'nın rastgele küçük bölümlere parçalanmasıyla üretilir. Bu tür fragmanlar genellikle uçlarındaki diğer fragmanlarla üst üste gelir. Fragmanlar, bir genomik organizma kütüphanesi oluşturmak için bir vektörde klonlanır.

Bir genomun tam diziliminin sebepleri:

(i) Genlerin keşfedilmesi için temel bilgi sağlar ve genlerin envanterini sağlar.

(ii) Genler arasındaki olası ilişkileri temsil eder.

(iii) Genom dizilimi ileri deneyler için bir dizi araç sağlar.

(iv) Bir organizmanın genetik bilgisi, gen sekansından elde edilir.

(v) Bir organizmanın tam genetik dizilimi, bir organizma oluşturmak için gereken tüm genetik bilgiyi sağlar.

Genom Sıralama için Kullanılan Metodolojiler:

(i) Bakteriyel Yapay Kromozom (BAC) indekslerinin yönlendirilmiş sekansları:

Bakteriyel yapay kromozomlar, çok uzun segmentlerin (yani 100.000 ila 300.000 bp) DNA'nın klonlanması için tasarlanmış plazmitlerdir. Bu vektörler, insert boyutunun 80-100 kb olduğu genomik kütüphaneler yapmak için kullanılır. Bin baz baz çiftinin DNA fragmanları BAC vektörüne klonlanır.

Genomik kütüphane, contig adı verilen ortak kısıtlama klonları yerleştirilerek taranır. Contig üyeleri, contig içindeki konumlarının kesin olarak belirlenmesine izin vermek için üst üste binen bazı bölgeler içerir.

Fiziksel haritalama yöntemlerinin nihai amacı, genomun her bir kromozomu için tam bir bitiş elde etmektir. Eşlenen eşler, büyük DNA parçalarını küçük parçalara bölerek dizilir. Kontigün her bir klonu dizildi. Nükleotit sekansı, tam genom sekanslanıncaya kadar tek başına klon bazında tanımlanır.

(ii) Rastgele av tüfeği sıralaması veya Aşağıdan yukarıya yaklaşımı:

Bir organizmada, bir başka organizmadan istenen herhangi bir geni, atışla vurularak klonlamak mümkündür. Bunun için ilk organizma genomunun tamamı, rastgele bir parça karışımı üretmek üzere endonükleaz ile sindirilir.

Genomik DNA'nın rastgele (shotgim) kütüphaneleri, genomik av tüfeği büyük insert BAC kütüphanesi (80-100 kb) ile birlikte küçük yani 2.0 kb ve orta, 10 kb insertli plazmid vektörler halinde oluşturulur. Fragmanlar plazmid vektörüne yerleştirilir ve rekombinant plazmitler, istenen konak hücreye dönüştürülür.

Atış tabancası sekansında rastgele seçilen klonlar, genomik kütüphanedeki klonlar analiz edilinceye kadar sekanslanır. Başka bir deyişle, rastgele silah atışlarında kromozomların bölümlere ayrıldığını ve daha sonra genomik DNA bölümünün milyonlarca küçük bölüme ayrıldığını ve bütün bölümlerin tarafsız bir şekilde dizildiğini söyleyebiliriz.

Örtüşen DNA alanları, genomik DNA'nın daha büyük ve daha büyük bölümlerini oluşturan eşleşir. DNA dizilimi, genomun en az üç katı kapsama sağlamak için hem küçük hem de orta uç plazmid kütüphanelerinden rastgele seçilen klonların her iki ucunda gerçekleştirilir.

Küçük DNA parçaları farklı plazmid moleküllerine rastgele yerleştirilir. Üst üste binen kesici uçlar durumunda, hepsi aynı genomik konumdan gelir, ancak birbirlerine göre sola veya sağa kaydırılan farklı bölgelerden gelir.

Örtüşen fragmanlar ya kota içine ya da söz konusu bölge için bir sıraya dizilir (av tüfeği yöntemi). Prokaryotik genomlar çok az ilgili DNA'ya sahiptir ve av tüfeği dizilimi iyi sonuçlar verir. Ökaryotlar birçok tekrarlı diziye sahiptir.

Bütün bunlar karışıklığa yol açar. Bununla birlikte, parçaların üst üste binmesi, hesaplama aşamasında hesaplama aşamasında kullanılır. Bilgisayar programı üst üste binen dizileri tanımlar ve bunları bir sürekli uzamaya birleştirir. Bu işlem, Celera Genomics tarafından yayınlanan tüm mikrobiyal genom dizilerini dizmek için başarıyla uygulanmıştır.