Sıtma Tanısında Son Gelişmeler

Sıtma Tanısında Son Gelişmeler - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Giriş:

Hindistan'da sıtma büyük bir sağlık sorunudur; Rajasthan ve Kuzey Doğu Devletleri'nde sık sık salgınlar meydana geldi. Rajasthan insidansında P. falciparum artmaktadır. Delhi'de P. vivax en yaygın türdür ancak P. falciparum'da da rastlanmaktadır. Dünya çapında bir sorun olan sıtma her yıl 1, 5 ila 2, 7 milyon insanı öldürüyor. Başka bir deyişle, her 12 saniyede bir kişiyi (genellikle 5 yaş altı bir çocuğu) öldürür. Ayrıca her yıl 300-500 milyon kişiye hastalık kapılıyor.

Hastalığın kontrolü için hızlı ve kesin tanı en önemlidir. Sıtma teşhisi genellikle klinik belirtiler temelinde yapılır ancak doğruluğu en iyi% 50'dir. Daha yeni, ileri teşhis teknikleri şimdi mevcuttur. Son zamanlarda yapılan immünoassay üzerine yapılan araştırmalar hızlıdır (<10 dak / test) ve en azından geleneksel mikroskopi kadar hassastır.

Işık Mikroskobu: Kalın ve İnce Kan Lekeleri:

Sıtmanın teşhisi için geleneksel olarak kabul edilen laboratuar prosedürü, mikroskobik incelemedir Giemsa veya Tarla lekeli kan lekeleridir. İdeal olarak, kan bir parmak delisi ile elde edilmelidir; Bununla birlikte, derhal delipunktur ve anti-koagüle edilmiş (EDTA veya heparin) alınan kan derhal incelenirse kabul edilebilir. Hem kalın hem de ince lekeler yapılmalıdır. Kalın smear, kırmızı hücreleri küçük bir yüzeyde 20 - 30 kez yoğunlaştırır, tekniğin hassasiyetini arttırır ve ince lekelerden çok daha iyidir. İnce smear, ancak, daha spesifiktir.

Teşhis için kabul edilen altın standarttır, ancak emek yoğun ve sonuçların yorumlanması, özellikle düşük parazitemi olmak üzere önemli bir uzmanlık gerektirir. Ek olarak, sıklıkla periferik kandan uzakta tutulan P falciparum parazitleri kolayca gözden kaçırılabilir.

Kan Lekelerinin İncelenmesiyle Parazitlerin Miktar Tayini:

Kalın lekelerde malarial parazitleri ölçmek için birçok yöntem vardır. Parazit seviyeleri ayrıca ince kan lekelerinin incelenmesiyle de ölçülebilir. Kalın lekelerin önemli bir dezavantajı, genellikle kullanılamayacak belirli bir uzmanlık derecesi gerektirmesidir.

Teorik olarak, denetçi 20 veya daha fazla lökosit / hpf içeren kalın yayılı alanları saymalıdır. Gerçekte, 20 veya daha fazla lökosit içeren alanlar sayılmayacak kadar kalındır, ancak okunması en kolay alanlar yalnızca beş veya altı lökosit / hpf içeren alanlardır.

Boyamadan önce, denetçi iyi hazırlanmış, kalın bir kan lekesi ile baskıyı okuyabilmelidir. İnce lekelerin muayenesi kalın lekelerin muayenesi kadar hassas olan onda biri kadardır. Bu nedenle, kan lekelerinin incelenmesi evrensel, 'altın standart' olarak kabul edilebilir olsa da, aslında tüm araştırmacılar tarafından, kalın smearlerde parazitleri saymak suretiyle parazitleri ölçmek için kullanılan tek bir standart yöntem yoktur.

Ayrıca, eğitimli personel altında, mikroskop eksikliği, birçok endemik bölgede kan smear incelemesinin yararlılığını sınırlar. Bu sınırlamaları kabul ederek, sıtmanın teşhisi için alternatif teknikler geliştirilmiştir.

Floresan Mikroskopi:

Sıtma teşhisinde üç flüoresan tekniği söz veriyor.

Bunlar:

(i) Ticari bir kit olarak mevcut olan kantitatif buffy-coat (OBC) yöntemi

(ii) Kawamoto Acridine Orange (AO) işlemi ve

(iii) Benzotiokarboksipürin (BCP) prosedürü.

Bu üç teknik hızlı ve gerçekleştirmesi kolaydır; 100'den fazla parazit / µL olduğunda, kalın smear incelemesi ile elde edilenlere eşdeğer hassasiyet ve özgüllük sergilerler.

Hem OBC hem de Kawamoto yöntemleri, bir örnekteki malarial parazitlerin nükleik asitlerini lekelemek için florokrom olarak Acridine Orange (AO) kullanır. BCP ayrıca nükleik asitleri lekeleyen bir florokromdur. AO spesifik değildir ve tüm hücre tiplerinden nükleik asitleri boyar.

Sonuç olarak, denetçinin flüoresan lekeli parazitleri diğer hücrelerden ve hücresel kalıntılardan ayırt etmeyi öğrenmesi gerekir. AO boyamasının 100 parazit / µL'den düşük parazit seviyeleri ile duyarlılığı yüzde 41, 7-93 olmuştur.

P. vivax ve P. falciparum için AP boyamasının spesifikliği sırasıyla yüzde 52 ve 93'tür. BCP yöntemi yüzde 90'dan daha fazla bir duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir. AO ve BCP'ye dayanan yöntemlerin önemli sınırlılığı, Plasmodium türlerini ayırt edememeleridir. AO tehlikelidir ve özel elden çıkarma gereklilikleri gerektirir.

OBC ve BCP, teknik olarak Kawamoto'dan daha zorlu. Kawamoto ve AO yöntemleri özel ekipman ve malzemeler gerektirir ve daha pahalıdır. Bir floresan mikroskobunun fiyatı, bu yöntemleri kullanmak isteyen laboratuarlar için sınırlayıcı bir faktör olabilir.

Spesifik Nükleik Asit Dizilerinin Tespiti:

Plasmodium parazitlere özgü nükleik asit dizilerinin tespiti faydalı olabilir. PCR tabanlı tekniklerde, yükseltilmiş hedef dizisi iç problarla tespit edilir veya jel elektroforezi ile analiz edilir. PCR tabanlı bir teknik kullanmanın en büyük avantajı düşük parazitemiyi saptama yeteneğidir. Canlı parazitlere sahip enfeksiyonlar yüzde 100 özgüllük ile tespit edilebilir.

Bununla birlikte, bu tür teknikler pahalıdır ve emek yoğundur, kapsamlı teknik uzmanlık gerektirir, birden fazla adım içerir ve uygulanabilir ve uygun olmayan organizmalar arasında ayrım yapmak için kullanılamaz.

Kan örneklerinde doğal olarak bulunan PCR inhibitörleri önemli sayıda yanlış negatif sonuçla sonuçlanabilir. Taşınmanın kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar da kaydedilmiştir.

Sıtma endemik olduğu bir alanda bağışçıları taramak için PCR tabanlı teknikler kullanılmıştır. Kan lekelerinin 'altın standart' olarak incelenmesiyle tahmin edilen PCR tabanlı yöntemlerin duyarlılığı ve özgüllüğü her biri yüzde 90 veya daha fazladır.

Ek olarak, PCR teknolojisindeki daha ileri gelişmeler, kısa sürede canlı parazitlerin canlı olmayanlardan ayırt edilmesine izin verebilir. Şu anda bu teknolojinin faydası, pahalı, uzmanlaşmış, laboratuvar ekipmanı, genetik teknolojiler ve 'temiz oda' tesislerinde eğitim almış personel ihtiyacı ve kullanılan yüksek enzim ve primer maliyeti ile sınırlıdır.

Antijen Algılama:

Sıtma için antikor saptama testleri duyarlılık ve aktifleri önceki enfeksiyonlardan ayırma yeteneklerinde sınırlıdır. Yeni nesil, antijen yakalama testleri daha az parazit saptama ve hızlı sonuçlar üretme kabiliyetine sahiptir (10-15 dakika). Tüm gerekli reaktifleri içeren ve kapsamlı bir eğitim veya ekipman gerektirmeyen, ticari olarak temin edilebilen kitlerdir.

Sadece P. falciparum ve dört parazit tarafından üretilen parazit laktat-dehidrojenaz (pLDH) antijeni tarafından üretilen yeni, hızlı, teşhis testlerinde, histidin bakımından zengin protein-2'de (HRP-2) kullanılan iki parazit antijeni vardır. plazodyum türleri, insanı enfekte ediyor. Her iki antijen de parazitin tüm aseksüel aşamaları tarafından kana salınır; pLDH antijeni, gametositler tarafından da üretilir.

En yeni antijen yakalama testlerinin gerçekleştirilmesi hızlı ve basittir ve yüksek kaliteli mikroskopi (yani 100-200 parazit / µL) ile karşılaştırılabilir algılama limitlerine sahiptir. 60-100'den fazla parazit / µL, HRP- 2 bazlı testler kalın smear mikroskopisi ile karşılaştırıldığında oldukça (>% 90) duyarlıdır ve (>% 90) spesifiktir.

Şu anda, bu iki test ticari olarak temin edilebilir, ParaSight F testi ve ICT (immünokromatografik) Sıtma Pf Testi. Her iki test de parmak delme örneklerinde gerçekleştirilir ve sadece P. falciparum sıtma tespit edilir.

Çubuklar veya karton testleri (ICT Pf Testi) üretmek için nitroselüloz şeritler üzerinde immobilize edilmiş HRP-2'ye monoklonal antikorlara dayanır. Her testte, pozitif bir sonuç, monoklonal antikorların hareketsiz hale getirildiği test şeridi üzerinde kırmızı bir çizginin görünmesiyle gösterilir.

Her iki test de bir kontrol kontrolü içerir; Testin geçerli sayılması için bir kontrol çizgisi görünmelidir. ParaSight F testinin duyarlılığı ve özgüllüğü, PCR ile karşılaştırılabilir olarak sırasıyla yüzde 88 ve 97'dir.

Her ne kadar HRP-2 tabanlı serolojik testler falciparum sıtmasının hızlı teşhisine izin vermiş olsa da, sınırlı yararları vardır. HRP-2 sadece P. falciparum'da bulunduğundan, HRP-2'nin tespitine dayanan testler vivax, ovale veya sıtmanın neden olduğu enfeksiyon ile negatiftir.

Falciparum olmayan sıtma vakalarının çoğu bu nedenle yanlış sıtma negatif olarak teşhis edilecektir. HRP-2 bazlı testlerin bir başka sınırlaması, HRP-2'nin klinik semptomlar kaybolduktan ve parazitlerin görünüşte konakçıdan temizlenmesinden kısa bir süre sonra kanda kalmasıdır.

Aslında, HRP-2 mumyalarda keşfedilmiştir. Bu antijen için yapılan testler bu nedenle inatçı, düşük seviyeli parazitemiye sahip olabilecek endemik bölgelere özgü insanları taramak için faydalı olmayabilir. HRP-2 antijeninin kalıcılığının olası nedeni iyi anlaşılmamıştır; gizli, yaşayabilir parazitlerin (muhtemelen tedavi başarısızlığının bir sonucu) veya çözünür antijen-antikor komplekslerinin varlığını yansıtabilir.

Israr, ayrıca başlatılan anti-sıtma tedavisinin türüne de bağlı olabilir. HRP-2 sinyali, görünüşte etkili kinin ve doksisiklin tedavisinden sonra 19 gün boyunca devam edebilir. Ayrıca artemeter tedavisi sırasında ve sonrasında kalıcı HRP-2 antijenemi gözlenmiştir.

Diğer kısıtlamalar, İKP-2 sisteminin teknik yönleriyle özel olarak ilgilidir. Örneğin, ParaSight F sisteminde kullanılan monoklonal IgG, romatoid faktörle çapraz reaksiyona girebilir ve yanlış pozitif bir tepkiye neden olabilir.

BİT Pf Testi, çapraz reaksiyona girmeyen bir monoklonal IgM kullanır ve romatoid faktör nedeniyle bu testte meydana gelen yanlış-pozitif reaksiyon raporları yoktur. Bununla birlikte, ICT Pf testi, saha koşullarında yararlılığını sınırlayan 4 ° C'de depolamayı gerektirir.

pLDH Bazlı Serolojik Testler:

Sıtmanın teşhisi için en yeni hızlı serolojik testler pLDH'nin tespitine dayanmaktadır. HRP-2'ye dayalı analizlerde olduğu gibi, bu testler 15 dakikadan daha kısa bir sürede elde edilebilecek şekilde hassas, spesifik ve gerçekleştirmesi kolaydır.

PLDH bazlı analizler P. falciparum ve diğer Plasmodium türlerini de ayırt edebilir ve pLDH yalnızca uygulanabilir parazitler tarafından üretildiğinden, anti-sıtma tedavisinin izlenmesinde de faydalıdır. P. falciparum'dan pLDH, Nicotinamid Adenin Dinükleotid'in (NAD) bir analoğu olan 3-asetilpiridin adenin dinükleotit (APAD) ile konak LDH'den (h-LDH) ayrılır.

PLDH bazlı analizler, yarı kantitatif, kuru, yağ çubuğu (OptiMAL); ve kantitatif, immüno-enzimatik bir yakalama deneyi. OptiMAL deneyi, biri P. falciparum'a özgü diğeri 4 Plasmodi'yi tanıyan iki monoklonal antikor kullanır.

Test edilen kan numunesi (10 LL parmak dikmesi, tam kan veya donmuş hemolizat) konjuge monoklonal antikor içeren 3 µL, lizing tamponu ile karıştırılır. Bu karışımın OptiMAL içine dalmasına izin verilir, yağ çubuğu.

3 dakika sonra, 100 uL temizleme tamponu eklenir. Kan örneğinde P. falciparum varsa, çubuklarda üç çizgi (her çubuğun üstünde, pozitif kontrolü temsil eden bir tane olmak üzere) oluşur.

İki çizgi, P. vivax, P. sıtma veya bazen de P. ovale'yi gösterir. Yeni biçimlendirilmiş bir OptiMAL-2 şeridi üç test çizgisine ve pozitif bir kontrol çizgisine sahiptir, bu da dört Plasmodium türünün tanımlanmasına izin verir.

Her test sadece kontrol hattı gelişirse ualid olarak kabul edilir. OptiMAL testinde kullanılan monoklonal antikorlar, leishmania, babesia ve patojenik bakteri veya mantarlardan LDH ile çapraz reaktivite için kapsamlı bir şekilde test edilmiştir ve bu çapraz reaktivite kanıtı bulunamamıştır.

HRP-2'nin periferik parazitemi düzeldikten sonra iyi bir şekilde kaldığı bulundu. Her ne kadar pLDH düzeyleri periferik parazitemiyi yakından takip etse ve kinin ve doksisiklin tedavisinden 3-5 gün sonra tespit edilemeyen değerlere düşse de, HRP-2 antijen seviyeleri sadece 19 gün sonra düşmüştür, hasta semptom ve görünüşte parazitsizdir.

Bu nedenle OptiMAL testi, anti-sıtma tedavisinin izlenmesinde değerli bir araç olmalıdır. Paraziteminin temizlenmesi ve pLDH'nin temizlenmesi birbirine paralel görünüyor.

OptiMAL testleri, çok yönlüdür. OptiMAL testi, kan lekeleriyle karşılaştırıldığında sırasıyla yüzde 94 - 88'lik duyarlılığa ve P. vivax ve P. falciparum için yüzde 100 ve 99'luk özgüllüğe sahiptir.

Bu test, epidemiyolojik bir araç olarak kullanılabilir, çünkü birden fazla Plasmodium türünün dolaşımda olduğu alanlarda, her köyde hastaları enfekte eden Plasmodium türlerini hızlı bir şekilde tanımlamak ve halk sağlığı çalışanlarına en uygun kemoterapiyi sunmalarını sağlamak için kullanılabilir .

Sonuç:

Geçtiğimiz birkaç yılda, kan lekelerinin geleneksel ve sıkıcı okunması yerine geçme çabaları (yaklaşık 100 yıl önce geliştirilen bir yöntem), mikroskopiye eşdeğer veya daha iyi hassasiyetler veren malaryal parazitlerin tespit edilmesine yönelik tekniklere yol açmıştır.

Her ne kadar PCR tabanlı yöntemler tartışmasız en hassas olsalar da, çok maliyetlidirler ve gelişmekte olan ülkelerin çoğunda rutin tanı için kullanılması muhtemel olmayan özel ekipman ve eğitime ihtiyaç duyarlar.

Parazitte ilaç direncinde rol oynayan gerginlik farklılıkları, mutasyonlar ve genler üzerine araştırmalar ve farklı sıtma salgınlarıyla ilişkili suşlar arasındaki ilişki düzeyini göstermek için özellikle yararlıdırlar. En umut verici, yeni sıtma teşhisi, serolojik yağ çubuğu testleridir.

ParaSight F, ICT Pf Testi ve OptiMAL dahil olmak üzere bu testler 15 dakika veya daha kısa sürede kullanımı kolay, yorumlaması kolay ve sonuç üretmektedir. Bu testler neredeyse kan lekelerinin mikroskopik incelemesi kadar hassastır, ancak sonuçları gerçekleştirmek veya yorumlamak için yüksek vasıflı personel gerektirmez.

OptiMAL testi, dört Plaspiodium türünün tümünü tespit edebilme ve ilaç tedavisinin etkinliğini takip edebilme avantajlarına sahiptir, çünkü yalnızca canlı parazitler tarafından üretilen bir enzimi ölçmektedir.

Yağ çubuğu testlerinin iki belirgin sınırı olsa da, bu testlerin yaygın kabul görmesini engellememelidir. İlk sınırlama duyarlılıktır. Halen piyasada bulunan üç tahlil, 50-100 parazit / µ1 hassasiyet eşiğine sahiptir. <50 parazit / µL içeren numuneler için hassasiyet, % 50 -% 70 arasındadır.

Bu hassasiyet düzeyi, endemik bölgelerde kalıcı yaşayanlar için, 500'den fazla parazit / µL kanından fazla olmadığı sürece, genellikle tedavi verilmeyenler için çok fazla bir sorun olmayabilir, fakat bu kişilerde sıtmanın teşhisinde sorun yaratabilir. endemik olmayan bölgelerden gelmekte fakat endemik bölgede yaşamakta, çalışmakta veya seyahat etmektedir.

Bununla birlikte, sıtma hastalarının büyük çoğunluğu, 50 parazit / µL'nin çok üzerinde parazit seviyelerine sahip olduğu için, yağ çubuğu testleri rutin olarak kullanılırsa az sayıda hasta yanlış teşhis edilir. Bu tür testlerin ikinci sınırlaması, en azından şu anda, onların maliyetidir.

Dünya Sağlık Örgütü, endemik bölgelerde bulunanların bunlardan yararlanabilmesi için sıtmaya yönelik tanısal testlerin 0, 40 ABD Doları / örnekten daha düşük maliyetli olması gerektiğini düşünmektedir. Yağ çubuğu testleri büyük miktarlarda üretilmediği sürece, bu fiyat elde edilemez ve üreticilerin buluşması için pratik değildir.

Yağ çubuğu testlerinin mevcut maliyetleri, alıcının konumuna ve sipariş edilen hacme bağlıdır. Örneğin, BİT Pf Testlerinin maliyeti gelişmekte olan ülkelerde 1, 30 ABD Doları / test arasında değişmektedir. Para 0Sight F testleri, 1, 20 ABD Doları / test karşılığında satıyor. OptiMAL şeridi şu anda 3.00 ABD Doları / test için satmaktadır.