Antijen ve Antikorların Tamamlayıcı Analizleri
Antijen ve Antikorların Tamamlayıcı Testleri!
Her üç kompleman aktivasyon yolunun tamamlayıcı bileşenlerinin her birinin doğru belirlenmesi için yöntemler ve tamamlayıcı sistemin birkaç enzimi ve düzenleyicisi mevcuttur.
Bununla birlikte, testlerin çoğu sadece araştırma laboratuvarlarında mevcuttur.
İki tip tamamlayıcı testi vardır:
1. Kompleman proteinlerini antijen olarak ölçen analizler.
2. Kompleman fonksiyonel aktivitesini ölçen analizler.
Kompleman proteinlerini antijen olarak ölçen analizler genellikle basit, ucuz, zaman alıcıdır ve birçok laboratuvarda yapılabilir. Ancak bu antijenik analizler, tamamlayıcı bileşenlerin fonksiyonel yetenekleri hakkında bilgi sağlamaz, çünkü bu tamamlayıcı antijen tahlilleri, hem fonksiyonel olarak aktif tamamlayıcı bileşenleri hem de tamamlayıcı bozunma ürünlerini tespit eder.
ben. Genel olarak, antijenik analizler fonksiyonel analizler kadar hassas değildir.
ii. Antijenik analizler, belirli vücut sıvılarında düşük seviyeli kompleman bileşenlerini tespit etmez.
iii. ELISA deneyleri, tamamlayıcı aktivasyonu sırasında oluşan tamamlayıcı bileşenlerin veya komplekslerin bölünmüş ürünlerinin ölçümü için kullanılabilir.
iv. Klasik yolla tamamlayıcı aktivasyonu, serumdaki C4d ve C4 seviyelerini takip ederek ölçülebilir.
v. C1r-C1s-C1INH komplekslerinin ELISA ölçümü, klasik yol yoluyla tamamlayıcı aktivasyonunun bir ölçüsünü sağlar.
vi. Alternatif yolun aktivasyonu, dolaşımdaki Bb veya C3bBbP komplekslerinin seviyelerini değerlendirerek ELISA yöntemiyle ölçülebilir.
vii. Klasik veya alternatif yolun aktivasyonu, iC3b seviyelerinin veya çözünebilir membran atak kompleksi sC5b6789 formunun ölçülmesi ile izlenebilir.
viii. Serumda veya plazmada anafilotoksin C3a ve C5a'yı ölçmek için ELISA kitleri mevcuttur.
Kompleman Tahlilleri için Örnek İşleme:
Numunelerin doğru kullanımı, tamamlayıcı fonksiyonel analizler için kritiktir. Tamamlayıcı bileşenlerin bazıları oldukça değişkendir.
ben. Çoğu fonksiyonel deney için, plazma yerine serum tercih edilir çünkü plazma elde etmek için kullanılan kalsiyum şelatörleri (EDTA, heparin gibi) anti-tamamlayıcı olabilir.
ii. Fonksiyonel analizler için kan oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca pıhtılaştırmalı ve daha sonra en az bir saat buzda kalmalıdır.
iii. Clq bağlanma deneyleri için kan oda sıcaklığında 2 saat boyunca pıhtılaşmalıdır. Pıhtı çırpılır ve 0 ° C ila 4 ° C'de beş dakika santrifüjlenir. Dondurucu çökeltici antikorlardan şüpheleniliyorsa, kanın pıhtı oluşumu ve santrifüjlenmesi 37 ° C'de yapılmalıdır çünkü numune soğutulursa kompleman fiksasyon oluşabilir.
iv. Serum veya plazma numuneleri çok sayıda küçük hacimlerde bölünmüş olmalı ve hemen 40 ila -80 ° C'de saklanmalıdır.
v. Sera transfer edildiğinde, iyice kapatılmalı ve büyük miktarda kuru buz içeren kaplara yerleştirilmelidir.
Tamamlayıcı Fonksiyonel Tahliller:
Kompleman fonksiyonel analizlerinde kullanılan tamponlar kritiktir çünkü molarite ve metal iyonu konsantrasyonlarındaki değişiklikler kompleman titeri değerlerini etkileyebilir. Klasik tamamlayıcı yol için CH50 testi: Klasik yolun en basit fonksiyonel testi toplam hemolitik tamamlayıcıyı ölçer.
Tamamlayıcı bileşenlerin herhangi birinin yokluğu, sıfır toplam hemolitik bir tamamlayıcı titresi (CH50) ile sonuçlanır. Koyun eritrositleri genellikle CH50'yi veya izole edilmiş kompleman bileşenlerinin fonksiyonel aktivitesini ölçmek için hedef hücreler olarak kullanılır. Koyun RBC'leri, diğer türlerin RBC'lerinden daha fazla antikora ve kompleman aracılı lizise karşı duyarlıdır.
Alternatif tamamlayıcı yolu için AH 50 testi:
Tavşan eritrositleri AH50'yi ölçmek için kullanılır. Tavşan RBC'leri, insan serumunun aracılık ettiği antikordan bağımsız lizise duyarlıdır.
ben. CH50 ve AH50 analizleri, kompleman bileşenlerinin genetik eksikliğini dışlamak için mükemmel tarama deneyleridir.
ii. AH50 değerlerinin azaldığı normal CH50 aktivitesi, alternatif kompleman yolundaki kusurlardan kaynaklanır.
iii. Terminal tamamlayıcı bileşenlerindeki eksiklikler, hem CH50 hem de AH50 aktivitelerinin kaybına neden olur.
iv. Tamamlayıcı bir bileşenin Homozigos eksikliği, hemolitik tahlili tamamen ortadan kaldırır.
Hemoliz derecesi, eritrosit konsantrasyonu, eritrositlerin kırılganlığı (yaşı), duyarlılık için kullanılan antikor miktarı, antikorun doğası (IgG veya IgM), tampon sisteminin iyonik gücü, PH gibi birçok faktörden etkilenir. reaksiyon süresi, sıcaklık ve kalsiyum 2+ veya magnezyum 2 + konsantrasyonları. İnsan serumundaki CH50 birimlerinin değeri, Von krough denklemi gibi birkaç yolla hesaplanır.
Bağımsız kompleman bileşenlerinin fonksiyonel eksikliğinin ölçümü:
Bir hastanın öyküsü ve belirtileri olası bir kompleman komponent eksikliği önerdiğinde, bireysel komponentin hemolitik titrasyonları gerekebilir. Eritrosit lizileri üretmek için, bütün kompleman bileşenlerinin (C1 - C9) mevcudiyeti ve aktivasyonu gereklidir. Herhangi bir bileşen mevcut değilse, hemoliz meydana gelmez. Bir hastanın serumunda veya plazmasındaki belirli bir kompleman bileşeninin bulunmadığını tespit etmek için her bir kompleman bileşeninin her birinin saf preparasyonları gerekir.
Bireysel tamamlayıcı bileşenlerini ölçmek için kısmen saflaştırılmış bileşenler gereklidir. Bununla birlikte, C4'ün ölçülmesi, C4 eksikliği olan (C4D) kobay serumu mevcudiyeti nedeniyle bir istisnadır. C2 eksikliği olan insanlardan ve gine domuzlarından ve C6 eksikliği olan tavşanlardan gelen Sera birkaç laboratuvarda mevcuttur.
Bireysel bileşenin fonksiyonel tamamlayıcı analizleri hassastır ve bir tamamlayıcı bileşenin aktivitesi hakkında doğru bilgi sağlar. Ancak bu analizlerin çoğu araştırma laboratuvarlarıyla sınırlıdır.
Bireysel Kompleman Bileşeninin Antijen Analizi ile Ölçümü:
Tek radyal immün difüzyon, C3, C4 ve faktör B gibi tamamlayıcı bileşenleri ölçmek için en yaygın yöntemdir. Tüm tamamlayıcı fonksiyonel analizlerinin, serumun (tamamlayıcı antidesten kaynaklanabileceği anti-tamamlayıcı etkisiyle) inhibe edilebileceği unutulmamalıdır. antikor kompleksleri, heparin, şelatlama ajanları ve toplanmış immünoglobülin).
Tamamlayıcı Fiksasyon Testi:
Antijen-antikor etkileşimi olduğunda, tamamlayıcı bileşenler aktifleştirilir ve tüketilir. Dolayısıyla, tamamlayıcı maddenin in vitro test tüketimi, antijen-antikor etkileşiminin varlığını gösterir. Bu prensip, kompleman fiksasyon testindeki antijen veya antikorları tespit etmek ve ölçmek için kullanılır.
Test iki aşamada yapılır. İlk aşamada, antijen-antikor etkileşimi meydana gelir ve tamamlayıcı tüketilir. İkinci aşamada, ilk aşamadaki reaksiyonda tamamlayıcının tüketilip tüketilmediğini tespit etmek için bir gösterge sistemi kullanılır.
ben. Kompleman birinci aşamada tüketilirse, ilk aşamada antijen-antikor reaksiyonunun gerçekleştiği anlamına gelir.
ii. Eğer kompleman tüketilmezse, ilk aşamada antijen-antikor etkileşimi olmadığı anlamına gelir.
Kompleman Fiksasyon Testi ile Antikor Tayini:
İlk bölüm:
Bilinen antijen ve tamamlayıcıların sabit konsantrasyonları (genellikle tamamlayıcı kaynağı olarak taze gine domuzu serumu kullanılır) alınır. Serum içeren (bilinmeyen antikorlar) eklenir ve inkübe edilir.
A. Bilinen antijen + tamamlayıcı + serum (mevcut olan karşılık gelen antikorlar). Tamamlayıcı kuluçka sırasında tüketilir.
B. Bilinen antijen + kompleman -1-serum (karşılık gelen antikorlar mevcut değil). Serum bilinen antijene özgü antikorları içermediğinden tamamlayıcı tüketilmez.
İkinci sahne:
Tavşan anti-koyun eritrosit antikorları ile kaplı koyun eritrositleri tüplere eklenir. Tamamlayıcı varlığında, koyun eritrositleri parçalanır (hemoliz). Kompleman yokluğunda eritrositler lize olmaz (hemoliz olmaz).
A. Kompleman birinci aşama reaksiyon sırasında kullanıldığından, antikor kaplı koyun eritrositleri lize edilmez. Bu nedenle hemolizin yokluğu, serumun testte kullanılan antijene karşı spesifik antikorlar içerdiğini göstermektedir.
B. Kompleman birinci aşamada kullanılmadığından, antikor kaplı koyun eritrositleri ikinci aşamada kompleman tarafından hemolizlenir. Bu nedenle hemoliz varlığı, serumun kullanılan antijene karşı spesifik antikorlar içermediğini göstermektedir.
Kompleman fiksasyon testleri klinik laboratuvarlarda ve araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Virüsler, viral enfeksiyonlara karşı serum antikorları, sifilise neden olan Treponema pallidum'a karşı antikorlar, anti-fungal antikorlar (Coccidioidomycosis immitis, Histoplasma capsulatum), anti-Mycoplasma pneumoniae antikorları ve anti-ricketsial antikorları tespit edildi.
