Enzim Bağlantılı İmmün Emici Tahlil (ELISA) Antijenini Belirleme Yöntemleri

Enzim Bağlantılı İmmün Emici Tahlil (ELISA) Antijeni Tayin Yöntemleri!

Enzim-bağlı immün emici yöntem, antijen veya antikoru tespit etmek için kullanılabilir. ELISA yönteminin diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır (Tablo 27.2).

ELISA yöntemi, aglütinasyon ve immünoelektroforez gibi eski yöntemlere göre 10 ila 1000 kat duyarlıdır. Bazıları burada tarif edilen, çeşitli ELISA modifikasyonları mevcuttur.

Tablo 27.2: Enzim immünolojik testlerinin avantajları

1. Enzimlerin amplifikasyon etkisi, daha hassas analizlerin geliştirilmesine yol açar

2. Reaktifler uzun raf ömrüne sahiptir ve nispeten ucuzdur

3. Çok çeşitli test konfigürasyonları geliştirilebilir

4. Ekipman daha az maliyetlidir ve yaygın olarak bulunur

5. Radyasyon tehlikesi yok

6. Küçük laboratuvarlarda da yapılabilir

Antikorların Test Edilmesi için ELISA:

Bilinen antijen, bir mikrolitre plaka oyuğuna (protein bağlanmasını maksimize etmek için işlenmiş küçük plastik plaka; 200 ul hacimli 96 oyuk içerir) üzerine kaplanır.

↓

İnsan test serumu kuyuya ilave edilir ve inkübe edilir.

ben. Serum kaplı antijene karşı antikorlar içeriyorsa, antikorlar antijenlere bağlanır.

↓

Bağlanmamış serum bileşenlerini çıkarmak için oyuklar yıkanır.

↓

Enzim konjuge anti-insan immünoglobülini (konjugat olarak bilinir) oyuklara eklenir ve inkübe edilir.

ii. Konjugat kuyudaki antijene bağlı antikorlara bağlanır.

iii. Test serumu antijene karşı antikor içermiyorsa, konjugat çözeltide kalır.

↓

Bağlanmayan konjugatı çıkarmak için oyuklar yıkanır.

↓

Kuyulara uygun bir substrat eklenir ve inkübe edilir.

iv. Antijen-antikor-konjugatlardaki konjugatın enzimi, kompleks üzerine etki eder ve renkli bir ürün elde etmek için substratı böler. Rengin gelişimi, kuyucuklarda kaplanan antijene özgü antikorun test serumunda bulunduğunu gösterir.

v. Rengin gelişmemesi test serumunun kuyucuklarda kaplanmış antijene karşı antikorları olmadığını gösterir.

↓

Reaksiyonu durdurmak için bir durdurma çözeltisi (genellikle IN sülfürik asit) eklenir. Sonra plaka bir ELISA okuyucusunda tutulur ve gözlerin optik yoğunluğu (OD) ölçülür. OD, test serumundaki antikor miktarına karşılık gelir.

Bilinen antikor konsantrasyonları kullanılarak bir grafik oluşturulabilir. Antikor konsantrasyonları X ekseni üzerinde çizilir ve karşılık gelen OD'ler Y ekseni üzerinde çizilir ve bir eğri çizilir. Test serumunun OD değerinin enterpolasyonu yoluyla, bir test serumundaki antikorların konsantrasyonu belirlenir.

ELISA'yı Test Etmek için Antijen:

Bir antijene bilinen bir monoklonal antikor (birincil antikor olarak adlandırılır), mikrotitre oyukları üzerine kaplanır.

↓

Antijeni içermesi gereken numune kuyucuğa eklenir ve inkübe edilir.

ben. Örnek karşılık gelen antijeni içeriyorsa, antijen, kuyudaki antikora bağlanır ve bir antijen-antikor kompleksi oluşturur.

↓

Bağlanmamış materyalleri çıkarmak için oyuklar yıkanır.

↓

Antijene karşı konjuge mAb (konjugat olarak adlandırılır) olarak bilinen bir enzim oyuklara eklenir ve plaka kuluçkalanır.

ben. Kuyu antijen-antikor kompleksi içeriyorsa, konjugat kompleks içindeki antijene bağlanır.

ii. Antijen-antikor kompleksi yoksa, konjugat çözelti içinde kalır.

↓

Bağlanmayan konjugatı çıkarmak için oyuklar yıkanır. Uygun bir substrat eklenir ve inkübe edilir.

ben. Kuyuda konjugat varsa, konjugatın enzimi substratı böler ve renkli bir ürün üretir.

iii. Renk gelişiminin olmaması, numunede antijen olmadığını gösterir (kuyucuklarda kaplanan antikora karşı).

↓

Reaksiyonu durdurmak için bir durdurma çözeltisi ilave edilir. Tek tek kuyuların OD'leri ELISA okuyucusunda okunur. Daha önce açıklandığı gibi bir grafik (X ekseni üzerinde farklı antijen konsantrasyonlarından ve Y ekseni üzerinde karşılık gelen OD'lerden oluşan) oluşturulmuş ve eğri çizilmiştir. Test numunesindeki antijenin konsantrasyonu, OD'sinin enterpolasyonu ile belirlenir.

Antikor Yakalama ELISA Yöntemi:

Mikro titre plakasının oyukları, insan karşıtı IgM antikorları ile kaplanır.

↓

Hastanın serumu eklenir ve inkübe edilir. Serumdaki IgM antikorları, oyuklardaki anti-insan IgM antikorlarına bağlanır.

Oyuklar yıkanır ve daha sonra bilinen bir antijen eklenir ve inkübe edilir.

ben. Kuyuda antijene karşı IgM antikorları varsa, antijen IgM antikoruna bağlanır ve kuyuda kalır.

↓

Bağlanmayan antijeni çıkarmak için oyuklar yıkanır

↓

Antijene konjuge mAb enzimi eklenir ve inkübe edilir.

ben. Eğer kuyucukta antijen varsa (anti IgM-IgM-antijen kompleksi), konjugat antijene bağlanacaktır.

↓

Bağlanmamış konjugatı çıkarmak için oyuklar yıkanır ve substrat eklenir.

ben. Renk gelişimi, hastanın serumunda antijene karşı IgM antikorlarının bulunduğunu gösterir.

ii. Rengin gelişmemesi, hastanın serumunun antijene karşı IgM antikorları içermediğini gösterir.

↓

Durdurma çözeltisi eklenir ve kuyucukların OD'leri ELISA okuyucusunda ayrı ayrı ölçülür. Antijene karşı IgM antikorlarının miktarı, daha önce tarif edildiği gibi bir grafik çizilerek belirlenebilir.

Bir antijene karşı IgG antikorlarını tespit etmek için benzer bir prosedür uygulanabilir.

ELISA tekniklerinde yaygın olarak kullanılan enzimler yaban turpu peroksidazı ve alkalin fosfatazıdır (Tablo 27.3). Bu enzimler mAb'lere kovalent olarak bağlanır. Renkli ürünler üretmek için bu enzimler tarafından çeşitli substratlar kullanılır. ELISA yönteminin son adımı enzimatik olduğu için, ELISA yöntemi son derece hassastır (yani, çok düşük konsantrasyonlarda antijen veya antikor saptanabilir).

ELISA deneylerinin duyarlılığı, ilave reaktifler kullanılarak arttırılır (Örneğin, biotin / avidinimmunoassay). Son zamanlarda, kemilüminesan ürünler üreten yaban turpu peroksidaz substratlarının kullanılması hassasiyeti daha da arttırmıştır. Tek bir sabit anda reaksiyonun ölçüsünden ziyade, reaksiyon oranının ölçülmesi, daha kesin nicel ELISA sonuçları verir.

Tablo 27.3: Enzim immunoassaylerinde kullanılan enzimlerin özellikleri:

Biotin-Avidin Geliştirilmiş ELISA:

MAb'yi bir enzim ile etiketlemek yerine, MAb biotin ile etiketlenebilir (Vitamin B ₁₂ ).

↓

Sonra enzim avidin etiketli (yumurta akının bir protein bileşeni) eklenir.

↓

Avidin, çok yüksek hassasiyet ve afinite ile biyotine bağlanır. Daha sonra substrat eklenir. Enzim (mAb-biotin-avidin-enzimde) kompleksi, alt-tabaka üzerine etki eder ve renkli bir ürün üretir.

Biotin-avidin geliştirme, ayrıca Immuno-fluorescent testlerinde kullanılır.

Mikropartikül Enzimi İmmünoassayler:

Mikro titre plaka oyuklarının antijen veya antikorlarla kaplanması yerine, küçük taneler (1 mm çapında) antijen veya antikor ile kaplanır ve ELISA deneyleri yapılır. Mikropartiküller, antijen veya antikor kaplaması için daha geniş bir yüzey alanı sunar, böylece daha yüksek antijen veya antikor konsantrasyonları kaplanabilir ve bu, bağlanma reaksiyonları için gereken sürenin kısaltılmasına yardımcı olur.

Floresan enzim immunoassay, floresan substratlar kullanmaları dışında diğer EIA'larla aynıdır. Floresan EIA'da florofor, bir enzim reaksiyonu ile üretilir. Floroforun optimum dalga boyunda uyarılmasının ardından, karakteristik bir dalga boyunda ışık yayar. Yayılan floresan ışığı ölçülür.

Zaman Çözünürlüklü Fluoroimmunoassay:

Bu metot test hassasiyetini arttırmak için özel enstrümantasyon ve özel floresan etiketlere ihtiyaç duyar. Bu tahlilde kullanılan floresan etiketi, uyarma ve emisyon arasında 100 ns veya daha fazla bir zaman periyoduna sahip gecikmeli bir floresans sergiler. Arka plan flüoresansından sorumlu olan maddelerin çoğu kısa bir bozunma süresine sahiptir. Bu nedenle, geciken flüoresans sinyalinin ölçümü, arka plan flüoresansının etkilerini azaltacaktır.

Bu amaca, floroforu heyecanlandıran hızlı bir ışık darbesi üreten, zamanla çözünen özel florometre kullanımıyla ulaşılır. Floresans, uyarıldıktan bir süre sonra ölçülür. Böylece, genellikle 10 ns'den daha az bozunan spesifik olmayan arka planın etkisi elimine edilebilir.

Gecikmiş floresan sergileyen floroforlar:

ben. Pirene türevleri, yaklaşık 100 ns'lik bir bozunma süresine sahiptir.

ii. Yaklaşık 50 ila 100 µs çok uzun bir bozunma süresine sahip nadir toprak metal şelat etiketleri (örneğin europium (Eu ³⁺ ), samaryum (Sm ³⁺ ) ve terbium (Tb ³⁺ )).

Chemiluminescent Immunoassay:

Kemilüminesan immünolojik testler (CL-EIA'lar), çeşitli enzimlerle reaksiyona giren kemilüminesan substratları kullanır. Kemilüminesan substrat-enzim reaksiyonu, biyolüminesansa benzer şekilde ışık üretir. Kemilüminesan EIA sistemleri hassasiyet, zaman verimliliği ve prosedürel basitlik açısından DEA'lara göre kesin bir gelişmedir.

Kemilüminesans immünolojik testler, işaret olarak kemilüminesans üreten molekülleri kullanır.

ben. Luminol türevleri

ii. Akridinyum esterleri

iii. Nitrofenil oksalat türevleri

iv. Elektrokemilüminesans için tripropilamin içeren rutenyum tri-bipridil

v. Temel olarak, test yöntemleri DEA'lardan / DEA'lardan farklı değildir.