HLA: Histouyumluluk Test Yöntemleri

Histo-Uyumluluk Test Yöntemleri!

HLA sistemi yaygın olarak polimorfiktir. HLA alellerinin polimorfik doğası başlangıçta serolojik yöntemlerle bulundu ve tanımlandı ve HLA antijenlerine sayılar verildi. Daha sonra aynı serolojik özgünlüğe sahip antijenlerin farklı amino asit dizilerine sahip olabileceği bulundu. 1999 yılına gelindiğinde, bilinen HLA allellerinin sayısı 1000'i aştı ve sayı hala artıyor. Yaygın polimorfizm nedeniyle, HLA alellerinin isimlendirilmesi karmaşıktır ve kişi histo-uyumluluk alanında olmadığı sürece bir kişinin isimlendirmeyi anlaması da zordur.

İlk dizilen allellere, serolojik özelliklerine karşılık gelen iki basamaklı isimler verildi. İlk iki haneyi, DSÖ HLA Sistem Faktörleri İsimlendirme Komitesi tarafından verilen kronolojik adlandırma sırasını gösteren iki basamak daha takip eder. (Örneğin. HLA-A2 geninden sekanslanan ilk alel, HLA-A 0201 olarak ve sekanslanan ikinci alel, HLA-A 0202 olarak adlandırılmıştır.)

HLA tiplemesi serolojik tiplendirme yöntemleri veya moleküler tiplendirme yöntemleri ile yapılır. Serolojik HLA tipleme yöntemleri, HLA moleküllerinin epitoplarını, moleküler yöntemler ise nükleotit sekanslarını tespit eder.

ben. Allel gruplarını tanımlayan HLA tiplemesi (genellikle serolojik özelliklere yakındır), düşük çözünürlüklü veya genel tiplendirme olarak adlandırılır (Örneğin, HLA-DRBl-04).

ii. Bilinen tüm alelleri çözen tipleme, yüksek çözünürlüklü HLA tiplemesi olarak adlandırılır (Örneğin, HLA-DR BI x401).

iii. Serolojik özelliklerin ötesine geçen ancak alel seviyesine ulaşmayan tipleme, orta çözünürlük yazımı olarak adlandırılır (Örneğin, HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

Ulusal İlik Bağışı Programı, bu karmaşık orta çözünürlük verilerinin yönetimini kolaylaştırmak için kod oluşturmuştur. Bu sistemde, HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / ismi DRBl-04EJV'dir.

Serolojik Yöntemlerle Histo Uyumluluk Testi:

Lenfositler serolojik HLA tiplemesi, antikor taraması ve çapraz eşleştirme için kullanılır.

HLA Typing İçin Lenfositlerin İzolasyonu:

ben. Periferik venöz kan Ficoll- Hypaque ile karıştırılır ve santrifüjlenir. Periferik kan mononükleer hücrelerini içeren tabaka aspire edilir, yıkanır ve kullanılır.

ii. Lenf bezlerinden izole edilen lenfositler ve kadavra dalakları kullanılır.

iii. Sınıf II antijenleri için HLA tiplemesi, zengin B hücre popülasyonları ile yapılır (normal periferik kan T hücrelerinin yaklaşık yüzde 80'i, yüzeylerinde sınıf II antijenleri içermeyen T hücreleri dinlendirir).

iv. Anti-CD2 veya anti-CD3 mAbs kaplı manyetik boncuklar, T hücrelerini izole etmek için kullanılır; ve anti-CD19 mAbs kaplı manyetik boncuklar, B hücrelerini izole etmek için kullanılır.

HLA Lenfosit Antijenlerinin Tespiti:

Mikro sitotoksisite deneyi, bir tamamlayıcıya bağlı lenf sitotoksisite deneyidir. HLA antijenlerine karşı farklı antikorlarla kaplanmış oyuklar içeren dondurulmuş tipleme tepsileri ticari olarak temin edilebilir.

Tepsinin her oyuğuna yaklaşık 2000 lenfosit dağıtılır ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. (Her oyuktaki antikorlar, eğer varsa, lenfositlerin yüzeyindeki spesifik HLA antijenlerine bağlanır.)

↓

Her kuyucuğa beş µl tamamlayıcı (genellikle tavşan serumu) eklenir ve 60 dakika süreyle inkübe edilir (tamamlayıcı proteinler, mAb'lerle kaplı lenfositlerin ölümüne neden olur. MAb, lenfositlerle bağlanma yokluğunda, tamamlayıcı aktive olmaz ve lenfositler öldürülmez).

↓

Boya eozin Y, ardından formaldehit (formaldehit reaksiyonu sabitler) eklenir.

↓

Daha sonra her bir oyuktaki ölü hücreler ve canlı hücreler, faz kontrast mikroskobu altında sayılır.

ben. Şişmiş ve karanlık hücreler ölü hücrelerdir (Boya eozin Y, ölü hücrelere girer).

ii. Parlak ve kırılma hücreleri canlı hücrelerdir (Boya eozin Y canlı hücrelere girmez).

Tepsideki her oyuk, ölü hücreler ve canlı hücreler için ayrı ayrı izlenir. Her oyuktaki ölü hücrelerin yüzdesi hesaplanır ve skorlama Tablo 27.5'e göre yapılır.

Tablo 27.5: HLA için lenf sitotoksisite testinin skorlaması:

Bir bireyin HLA tipi, bireyin lenfositlerinin, tamamlayıcıya bağlı lenf sitotoksisite testinde kullanılan farklı antiserumlarla reaksiyonunun yorumlanmasıyla belirlenir.

ben. Her bireyin lenfositlerin yüzeyinde iki HLA-A, iki HLA-B ve iki HLA-C antijenine sahip olması beklenir.

ii. Bir birey testte yalnızca bir HLA-A veya HLA-B veya HLA-C antijeni gösterirse, muhtemelen testte kullanılan bu antijen veya antiserum panelinin ikinciye karşı spesifik antikoru bulunmadığı için homozigottur. antijen veya lenfosit yüzeyinde düşük HLA moleküllerinin ifadesi vardır.

HLA-DR ve HLA-DQ antijenleri için tamamlayıcıya bağlı lenf sitotoksisite deneyi, mAB kaplı manyetik boncuklarla izole edilmiş B hücreleri veya naylon yün üzerinde izole edilmiş B hücreleri kullanılarak yapılır.

HLA tiplendirme serumlarının çoğu, multiparous kadından elde edilir. Mutioparous kadınlar, fetusların HLA antijenlerine tekrar tekrar maruz kaldıklarından, multiparous kadınların serumları, HLA antijenlerine karşı antikorlara sahiptir. Bir bireyin HLA antijenlerini yazmak için yaklaşık 200 farklı antiserum kullanılır.

Başlangıçta, HLA antijeninin her birine yönelik mAb'lerin geliştirilebileceği ve HLA tiplemesinin basit olacağı düşünülmüştü. Ancak birçok mAb, HLA antijenlerinin özel epitoplarına değil, ortak epitoplara bağlanır. Ayrıca, birçok murin mAb'ı tamamlayıcıyı sabitlemez (ve bu nedenle tamamlayıcı bağımlı lento sitotoksisite deneylerinde kullanımı sınırlıdır).

Bununla birlikte, murin mAb'ler, ELISA yönteminde ve tamamlayıcı gerektirmeyen akış sitometrisi yönteminde kullanılabilir. Geç saatlerde, birçok laboratuvar serolojik HLA yazmasından ziyade moleküler HLA yazmayı kullanmayı tercih eder.

Nakil Alıcının Serumunun l-ILA Antijenlerine Karşı Antikorlar için Taranması (Antikor taraması):

Bekleyen bir organ nakli alıcısının serumunda HLA antijenlerine karşı antikorların varlığı genellikle tamamlayıcıya bağlı lenf sitotoksisitesi ile yapılır. Bilinen HLA antijenleri ve tamamlayıcısı olan lenfositler, alıcının serumuyla karıştırılır. Uygun inkübasyondan sonra, ölü lenfositler ve canlı lenfositler sayılır. Panel yüzde reaktif antikoru (PRA) daha sonra hesaplanır.

PRA = Pozitif hücre sayısı / Toplam panel hücre sayısı x 100

PRA, bekleyen alıcının HLA antijenlerine karşı hassasiyetinin derecesini gösterir.

Serum HLA Antikorlarının Taranması için ELISA Yöntemi:

ELISA yöntemi kolay, hızlıdır ve tamamlayıcı gibi canlı lenfositler gerektirmez. Afinite ile saflaştırılmış HLA antijenleri, mikrotitre plakasının duvarlarında kaplanır

↓

Alıcının serumu eklendi ve inkübe edildi

↓

Yıkama işleminden sonra, enzim eşlenikli anti-insan IgG eklenir ve inkübe edilir.

↓

Yıkandıktan sonra substrat eklenir ve inkübe edilir.

ben. Belirli bir oyukta rengin gelişimi, söz konusu oyuk üzerinde kaplanmış HLA antijenine karşı IgG antikorlarının varlığını gösterir.

ii. Belirli bir oyukta rengin gelişmemesi, oyuk üzerinde kaplanan belirli HLA antijenine karşı antikor bulunmadığını gösterir.

Serum HLA Antikorlarını Tespit Etmek İçin Akış Sitometresi:

HLA antijenleri ile kaplı mikro boncuklar, hastanın serumuyla ve daha sonra flüoresan etiketli anti-insan IgG antikorları ile inkübe edilir. Arka plan üzerinde lekelenen boncukların yüzdesi, hastanın yüzde panel reaktif antikorlarının (PRA) ölçüsünü sağlar.

Çapraz eşleştirme:

Bekleyen bir alıcının kanı, donör HLA antijenlerine karşı antikorlar içeriyorsa, donör hücrelerinde bulunan HLA antijenleri, nakli üzerine alıcının antikorları tarafından saldırıya uğrayacaktır. Bu nedenle, nakil işleminden önce, alıcının donör HLA antijenlerine karşı antikorları olup olmadığını bilmek önemlidir.

Verici HLA antijenine spesifik antikorlar alıcının serumunda mevcutsa, nakil reddedilecektir. Önerilen donör HLA antijenlerine karşı bekleyen alıcının serum antikorlarının varlığını tespit etmek için çapraz eşleştirme yapılır.

Lenf sitotoksisitesi Periferik Kan Lenfositleri ile Eşleşme:

Önerilen donörün periferal kan lenfositleri (yaklaşık yüzde 80 T hücresi (MHC sınıf I antijenleri taşıyan) ve yüzde 20 B hücresi ve monositleri (MHC sınıf I ve sınıf II antijenlerini taşıyan) içeren alıcılar serum ile karıştırılır ve kuluçkalanır. .

↓

Tamamlayıcı eklenir ve inkübe edilir.

↓

Boya eozin Y eklenir ve inkübe edilir.

ben. Ölü ve yaşayabilir hücrelerin sayısı sayılır ve ölü hücrelerin yüzdesi hesaplanır. Yüzde 50 veya daha fazla hücre ölümü, güçlü bir pozitif çapraz eşleşmeyi belirtir (yani, alıcının serumunun, donör HLA antijenleriyle reaksiyona girebilen antikorları vardır). Bir alıcı ile önerilen bir donör arasındaki güçlü bir pozitif çapraz eşleşme, donörden alıcıya organ nakli için bir kontrendikasyondur.

Alıcının antikorlarının, sınıf I veya sınıf II antijenlerine karşı yönlendirilip yönlendirilmediğini bulmak için, T hücresi lenf sitotoksisite çapraz eşleşmesi (zenginleştirilmiş T hücreleri kullanılarak) veya B hücresi lenf sitotoksisite çapraz eşleşmesi (zenginleştirilmiş B hücreleri kullanılarak) yapılır.

Akış sitometresi çapraz eşleşmesi, lenfositlerin yüzeyindeki HLA antijenlerine karşı IgG antikorlarının tespiti için görsel serolojik yöntemlerden 30-250 kat daha hassastır.

Önerilen donörün periferal kan lenfositleri, T hücrelerine bağlanan anti-CD3 mAb'leri işaretli (örneğin yeşil ışık yayan bir flüoresan boya) ile inkübe edilir.

↓

Etiketli ani-CD3'e bağlı T hücreleri, akış sitometresindeki B hücrelerinden ayrılır.

↓

Ayrılmış, lekeli T hücreleri şimdi bekleyen alıcının serumuyla kuluçkaya yatırılır.

ben. Vericinin T hücresi HLA antijenlerine karşı vericinin serum antikorları varsa T hücrelerine bağlanır.

↓

Yıkandıktan sonra, anti-insan IgG etiketli bir flürokrom (yeşil dışındaki bir renk yayan, kırmızı renk olan) eklenir ve inkübe edilir.

ii. Anti-insan IgG etiketli florokrom, alıcı T hücrelerine bağlı olan alıcının HLA antikorlarına bağlanır.

Akım sitometresi, T hücrelerinin (kırmızı ve yeşil renk) ve T hücrelerinin (yeşil renk) sayısını sayar ve bir histogram oluşturur.

Lenfositlere Karşı Otoantikorlar için Çapraz Eşleştirme:

Bir çapraz eşleşme sırasında, alıcının serumundaki lenfositlere karşı otoantikorlar, spesifik olarak donör lenfositlerine bağlanabilir ve yanlış pozitif bir çapraz eşleşme sonucu verebilir; ve sonuç olarak, donör, bağış organından belirli alıcıya hatalı olarak diskalifiye edilir. Otoantikorlar ayrıca spesifik anti-donör antikorların varlığını da maskeleyebilir.

Lenfositlere karşı otoantikorların varlığı, alıcının kendi lenfositleri ve serumunun standart bir sitotoksisite testinde birleştirildiği oto çapraz eşleşme ile tespit edilir. Otoantikor çapraz eşleşmeleri, test edilen her serum için tüm canlı donör çapraz eşleşmeleri ile birlikte rutin olarak yapılır.

HLA Yazma için Moleküler Biyoloji Yöntemleri:

Moleküler tiplendirme yöntemlerinin çoğu, yazmak için gereken HLA gen segmentlerini seçici olarak büyütmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğini kullanır.

Sekansa Özel Astar (SSP) Yazma:

Bireyin DNA'sı hücrelerden veya dokulardan ekstrakte edilir

↓

Farklı HLA genleri için farklı primer setleri içeren tüplere DNA eklenir. Ek bir primer primer seti, tüm tüplerde amplifikasyonun pozitif kontrolü olarak dahil edilir.

`↓

PCR reaksiyonunun diğer bileşenleri (DNA nükleotitleri, DNA polimeraz, tampon gibi) eklenir ve termal döngü gerçekleştirilir.

↓

Amplifiye ürünler etidyum bromürlü jelde elektroforezlenir ve UV ışığı altında fotoğraflanır.

ben. Bandın varlığı, DNA numunesinin, belirli HLA tipine karşılık gelen sekansa sahip olduğunu gösterir.

ii. Bandın olmaması, DNA numunesinin HLA tipinin özel sekansını içermediğini gösterir.

iii. Yorumlama için dahili amplifikasyon kontrol bandı mevcut olmalıdır.

HLA tiplemesi için primer setleri ticari olarak temin edilebilir.

ben. HLA-A, B ve C için yaklaşık 100-200 reaksiyon yazılması gerekir.

ii. HLA-DRB yazarken, yaklaşık 20-30 reaksiyon gerekir.

Sekansa özgü Oligonükleotid Probu Hibridizasyonu (SSOP):

SSOP yöntemi, HLA hedefinin seçici amplifikasyonunu ve ardından bir oligonükleotit prob paneline hibridizasyonunu içerir. İki SSOP formatı vardır.

ben. Nokta veya slot lekesi:

Amplifiye edilmiş DNA katı desteğe (örneğin naylon membran gibi) bağlanır ve hibridizasyon probu çözelti içindedir.

ii. Ters nokta veya slot lekesi:

Prob, katı desteğe bağlanır ve çözelti içinde çoğaltılmış DNA'ya melezlenir.