Polimeraz Zincir Reaksiyonunun İlk 3 Sıralı Basamağı (PCR)

Aşağıdaki noktalar polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) ilk üç sıralı adımını vurgulamaktadır. Ardışık adımlar şunlardır: Denatüre 2. Tavlama 3. DNA'nın uzatılması.

Sıralı Adım # 1. Denatüre:

İlk adım DNA'yı denatüre etmektir (hem Primer DNA hem de Native DNA). İki DNA dizisinin ayrılması, iki standı bir araya getirirken denatüre etme olarak bilinir, yeniden tavlama veya hibridizasyon olarak adlandırılır (Şekil 48.1). DNA'nın denatüre edilmesi ve yeniden tavlanması keşfi, Marmor ve Lane (1960) tarafından yapay olarak yapılmıştır.

Onlara göre, çift sarmallı DNA, yüksek bir sıcaklıkta (90-95 ° C) ısıtılarak ve iki farklı DNA sarmalının (çift sarmallı DNA) hibritleştirilmesi veya birleştirilmesiyle iki ayrı tek sarmal (denatüre) ayrılabilir. sıcaklığı düşürerek (50-56 ° C).

PCR'ın çalıştığı ana prensip budur. İkinci ilke, DNA polimeraz enziminin yardımıyla primerin uzatılmasıdır.

Doğal DNA, primer ve DNA polimeraz enzimi (Tag polimeraz), bir PCR tüpüne eklenir ve sıcaklık, denatüre etmek ve melezleştirmek için PCR makinesinde yükseltilir ve düşürülür.

Sıralı Adım # 2. Tavlama:

DNA'yı denatüre ettikten sonra, bir sonraki adım, sentezlenen primerin istenen hedef dizinin karşıt DNA ipliklerine tavlanmasını sağlamaktır. 95 ° C'den 50/56 ° C'ye düşürülürse tavlama (hibridizasyon) oluşabilir. Daha sonra sıcaklık makinede düşürülür.

Sıcaklık düşürülür düşmez, doğal DNA zincirleri sadece birbirlerine değil aynı zamanda primerleri de bağlar. Bu spesifik hibridizasyon veya tamamlayıcı nükleotidlerin "rekombinasyonu", pek çok rekombinant DNA için hem gerekçeyi hem de pratik temeli sağlar (Şekil 48.2).

Sıralı Adım # 3. DNA'nın uzatılması (Taq Polimeraz Enzimi gereklidir):

Primerler tavlandıktan sonra, başlangıç ​​noktası olarak oligonükleotit primer kullanılarak uzatılmalıdırlar. DNA polimeraz enziminin DNA sentezi için gerekli olduğunu açıkladı. Bu nedenle, primerin uzatılması için, yüksek sıcaklıkta enzimin tahrip edilmemesi için termo kararlı bir DNA polimerazına ihtiyacımız vardır.

Termo kararlı polimeraz (Taq polimeraz), Thermus aquaticus'tan izole edilir. Taq polimeraz, PCR reaksiyonunun gerçekleştirilmesinde büyük bir avantaja sahiptir. 70 ° C civarında optimum aktivite sıcaklığına sahiptir ve ısıtma ve soğutma işleminden sonra her bir test tüpüne taze enzim eklenmemelidir.

Termo kararlı DNA polimeraz şimdi farklı ticari isimler (TM) altında farklı kaynaklara sahip farklı şirketler (Thermus aquaticus hariç) tarafından üretilmektedir. Astarın uzatılması için, termo kararlı DNA polimeraz tüp içine eklenir ve sıcaklık 65-70 ° C'ye yükseltilir.

Sonraki ayırma döngüsü (denatüre etme), primer hibridizasyon (tavlama) ve şerit sentezi (uzatma) döngüleri, eğer önceki döngü yeni bir şablon olarak kullanılıyorsa, yükseltilmiş sekansı kullanarak hedef sekansların üssel amplifikasyonunu sağlar (Şekil 48.2). ).

Astar Yapımı:

Primerler kısa sekanslıdır (çoğunlukla RNA), DNA fragmanının her bir ucu için bir tane olan primer olarak adlandırılan iki nükleotit yapmak için kullanılır ve bir DNA polimerazının bir deoksiribonükleotit zincirinin sentezini başlattığı serbest bir 3-OH ucu sağlar.

Bir dizi duyu yönünde, diğeri duyu-karşıtı yönde yapılır. (Şekil 48.2). Astar, ücretsiz DNA iplikçiklerinin sentezini hazırlamak için kullanılır ve primerler arasındaki DNA'nın, büyütülecek olan ilgi konusu olacağı şekilde tasarlanır.

Eğer haberci RNA (mRNA) büyütülürse, RNA'ya bağımlı bir DNA polimerazı, ters transkriptaz ile serbest DNA'ya (cDNA) dönüştürülmelidir. CDNA kompleksi, daha sonra PCR reaksiyonu için şablon haline gelen çift sarmallı DNA olarak değiştirilir.

Bu genellikle ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT PCR) olarak bilinir. Astarlar yapay olarak üretilebilir veya firmalardan satın alınabilir.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, büyütülmüş ürünler (DNA) jel elektroforezi ile görselleştirilebilir. DNA molekülünün önemli fiziksel özelliği, her bir nükleotidin, fosfat grubundan kaynaklanan net bir negatif yüke sahip olmasıdır.

Bu nedenle, bir elektrik alana maruz kalan farklı boyuttaki fragmanlar, büyüklükten daha hızlı göç eden küçük fragmanlarla, büyüklüğe bağlı olarak pozitif elektroda doğru pozitif olarak göç etme eğilimindedir. Bu elektrik yüküne dayalı ayırma işlemine elektroforez denir.

DNA numuneleri, bir sınırlama enzimi (endonükleaz) ile farklı boyutlardaki fragmanlara sindirildikten sonra agroz jeli veya akrilamid gibi ortamları desteklemek için eklenir. Jelin gözenekleri yüzdesine bağlıdır ve (moleküler) bir elekle karşılaştırılabilir. Bu nedenle, DNA fragmanlarının jel boyunca geçiş hızı, hem DNA fragman büyüklüğüne hem de uygulanan voltaja bağlıdır.

Spesifik DNA fragmanını ayırma ve çıkarma prosedürü Southern lekelemedir. Bu tekniğin önemi, tek kordonlu parçanın kılcal hareketle katı bir destek ortamına (Naylon veya selüloz membran) aktarılabildiği ve ısınmadan kalıcı olarak sabitlenebilmesidir (Şekil 48.3).

Elektroforezden sonra, DNA modeli etidyum bromür lekesiyle muamele edildikten sonra UV lambası altında görselleştirilebilir; etidyum bromür bir floresan boyadır. Agroz jel elektroforezi, parçaları 100 baz çiftinden 60000 baz çiftine (60 kb) ayırırken, poliakrilamid jeller, fragmanları 1000 baz çiftinden (1 kb) etkili bir şekilde ayırır.

Darbe jel elektroforezi (PFGE), DNA fragmanlarının 2kb'ye kadar ayrılmasını mümkün kılmıştır. Bu prosedürde, elektrik alanı, DNA moleküllerini her darbe veya elektrik akımı arasında yeniden yönlendirmeye zorlayan farklı yönlerde değiştirilir. Bilinen bir geni tanımlamak için en iyi teknik budur.

Endonükleazlar 3, 4, 5, 6 veya 8 baz çiftini tanıyabilir ve piyasada bulunur.

PCR tamponları / tuzları.

Taq DNA polimeraz için, tampon aşağıdaki gibi yapılır:

50 mM KCI

Oda sıcaklığında 10 mM Tris-HCI

Dimetil sülfoksit (DMSO) ve glikol, hedef çok yüksek denatürasyon sıcaklığına sahip olduğunda PCR tamponlarında yardımcı çözücü olarak kullanılır.

Deoksinükleotit trifosfat (dNTP'ler) iyon kofaktörlerdir.

Şimdi biyoteknoloji şirketleri hazırlanmış çözümler sunmaktadır.

Temel ilke şu şekilde tanımlanmaktadır:

DATP (adenin trifosfat), dCTP (sitosin), dGTP (gunin), dUTP (uracil) baz çiftine göre ve primerin uzatılmasında ve sonuçta hedef dizinin kopyalanmasında kullanılan dört dNTP vardır.

DNTP, Mg2 ⁺ ile bağlanır. Bir reaksiyonda mevcut olan dNTP miktarı, optimum enzim aktivitesi için mevcut olan serbest Mg2 ⁺ miktarını belirleyecektir. Stok dNTP çözeltileri, Tris bazı ile pH 7.0'a nötrleştirilmeli ve konsantrasyonları spektrofotometrik olarak belirlenmelidir.

Substrat ve Substrat Analogları:

Taq polimeraz çok etkili çalışır (dNTP). Bununla birlikte, Tag DNA polimeraz substratın yerine bazı modifiye substratlar mevcuttur. DogoxigenindNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP ve floresan etiketli dNTPS'dir.

Aşağıdaki PCR tipleri genel kullanımdadır:

(1) İç içe PCR;

(2) RT-PCR;

(3) Çapa PCR;

(4) Asimetrik PCR;

(5) Ters PCR;

(6) DOP-PCR.