Batı Proteinlerin Lekelenmesi

Batı Proteinlerin leke!

Proteinler, iyonik bir deterjanla (SDS: sodyum dodesil sülfat) 100 ° C'de inkübe edilerek denatüre edilir.

SDS, bütün proteinleri düzgün bir şekilde kaplar ve proteinlerin yüzey yükünü negatif hale getirir.

↓

Denatüre protein daha sonra poliakrilamid jelde elektroforezlenir. Proteinler moleküler ağırlıklarına bağlı olarak farklı bantlar olarak ayrılırlar.

↓

Ayrılan proteinler, bir elektroforetik olarak bir filtre kağıdına (naylon veya nitroselüloz) aktarılır.

↓

Filtre kağıdı daha sonra antiserumlarla proteinlere karşı inkübe edilir. Antikorlar, filtre kağıdı üzerindeki karşılık gelen protein antijenlerine bağlanır ve antijen-antikor kompleksleri oluşturur.

↓

Filtre kağıdı, bağlanmamış serum bileşenlerini çıkarmak için yıkanır.

↓

Filtre kağıdına enzim etiketli anti-immünoglobulin (konjugat olarak bilinir) eklenir ve inkübe edilir.

↓

Konjugat, filtre kağıdındaki antijen-antikor kompleksindeki antikora bağlanır.

↓

Filtre kağıdı, bağlanmamış konjugatı çıkarmak için yıkanır ve substrat eklenir ve inkübe edilir.

ben. Antijen-antikor komplekslerinin olduğu yerlerde renkli bantlar gelişir.

iii. Bandın gelişmemesi, test serumunda antijene karşı karşılık gelen antikorun bulunmadığını gösterir.

Antijenlerle emprenye edilmiş filtre kağıtları daha uzun süre saklanabilir.

Western blot testi, Hepatit C virüsü antikorlarını tespit etmek için yaygın olarak kullanılır ve insan immün yetmezlik virüsüne (HIV) karşı antikorların saptanması için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır.

Ticari şirketler, ayrı HIV antijenli filtre kağıtlarını emdirir ve laboratuvarlara tedarik sağlar. Laboratuvarda, hastanın serumu filtre kağıdına eklenir ve serumda HIV'e özgü antikorların varlığını tespit etmek için işlenir.

Radioimmunoassay:

Radioimmunoassay (RIA) ilk olarak Rosalin Yalow ve Berson (1959) tarafından geliştirilmiştir. Metotta sayısız değişiklik yapılmıştır. Rekabetçi DEA ve rekabetçi olmayan DEA olmak üzere iki temel DEA tekniği vardır.

Farklı radyoizotoplar etiket olarak kullanılır (Tablo 27.4) ve radyoaktif emisyonlar, sintilasyon sayacı kullanılarak dakikadaki sayım (CPM) cinsinden ölçülür. En popüler etiket olan ¹²⁵ I, sinyal sayımı için daha kısa bir süreye ihtiyaç duyuyor, ancak kısa yarı ömrü nedeniyle sınırlı bir raf ömrüne sahip. Trityum (3H) radyoizotop sayımı için daha uzun zaman gerektirir ve dolayısıyla toplam test süresi artar.

DEA'nın avantajları:

ben. Hassas ve kaliteli

ii. İzotop eşleniği kolaydır

iii. Optimizasyon olmadan sinyal algılama

Tablo 27.4: Radyoimmünassay'da kullanılan radyoizotopların özellikleri:

İzotop	Yarım hayat	Çürüme tipi	Spesifik aktivite (mCi / µmol)
¹²⁵ ben	60 gün	γ	2200
¹³¹ I	8.1 gün	Β-, γ	16100
³ H	12.3 yıl	β-	29
¹⁴ C	5760 yıl	β-	6062
³² p	14.3 gün	β-	9120