Nötrofil Fonksiyon Testleri
Nötrofil Fonksiyon Testleri!
1. Nötrofillerin kemotaksisi, aşağıdaki yöntemlerle değerlendirilebilir:
a. Modifiye Boyden odası deneyi:
Boyden odası, küçük gözenek boyutuna sahip bir filtre ile ayrılmış bir üst ve alt odadan oluşur.
Nötrofil süspansiyonu üst odaya yerleştirilir ve kemotaktik bir madde alt odaya yerleştirilir. Nötrofil göçünün derecesi, filtrede hapsolmuş nötrofillerin sayısını ve alt odadaki nötrofillerin sayısını akış sitometrisi ile saymak suretiyle değerlendirilir.
b. Kuyular, yarı katı bir ağar içinde açılır:
Nötrofil süspansiyonu, kemotaktik madde ve kemotaktik olmayan bir madde, farklı oyuklara yerleştirilir. Hücrelerin yarı katı agar içerisinden kuyu içeren kemotaktik maddeye doğru göçü mikroskobik olarak belirlenir. Kemotaktik olmayan maddeye doğru göç, hücrelerin (kemo kinesis olarak da bilinir) rastgele hareketini temsil eder.
2. Nötrofil fagositoz:
Nötrofillerin fagositik kapasitesini değerlendirmek için çeşitli parçacıklar kullanılabilir. Parçacıklar, nötrofillerle inkübe edilir ve daha sonra nötrofillerin içindeki parçacıkların mevcudiyeti için mikroskopik olarak gözlenir. Hücre yüzeyine bağlı parçacıklar asit muamelesiyle uzaklaştırılır, böylece hücre yüzeyine bağlı parçacıklar hücre içi parçacıklar olarak sayılmaz.
Fagositler tarafından partiküllerin doğrudan sayılmasını sağlayan floresan etiketli veya radyoaktif partiküller de artık mevcuttur.
3. Solunum patlaması ve degranülasyonunun belirlenmesi:
Kronik granülomatöz hastalık (CGD), fagositler tarafından hücre içi öldürmenin, fagositik hücrelerin süper oksit anyonu ( 02 - ) üretememesi nedeniyle etkilendiği bir bağışıklık yetersizliği hastalığıdır.
a. Nitroblue tetrazolium (NBT) slayt testi:
NBT berrak, sarı, suda çözünür bir boyadır. NBT koyu mavi, formazon O 2 - ile azaltıldı. Nötrofiller PMA ile muamele veya LPS'ye maruz bırakarak aktive edilir. Aktive edilmiş nötrofiller daha sonra NBT ile inkübe edilir. Nötrofiller O 2 üretirse, NBT koyu mavi formazona indirgenir ve mikroskop altında görselleştirilir. Formazonun nötrofillerden çıkarılması ve formazonun bir spektrofotometre ile analiz edilmesiyle nicel bir analiz yapılabilir. Tam NADPH oksidaz aktivitesi eksikliği olan çocuklar NBT testinde büyük bir eksiklik gösterir. Ancak kısmi NADPH oksidaz aktivitesi olan çocuklar kantitatif test ile daha iyi tespit edilir.
b. 2'7′-dikloro-fluoreserin (DCF) kullanarak Akış sitometri deneyi:
NADPH oksidaz aktivitesi sırasında oluşan 02 - enzim süperoksit dismutaz tarafından H202'ye dönüştürülür. H202 başka bir mikrobisidal kimyasaldır. H202, flüoresan olmayan bileşik DCF'yi, akış sitometresi ile tespit edilen bir flüoresan bileşiğe oksitlemektedir.
Fagositler, DCF ile inkübe edilir ve DCF, hücrelere girer.
↓
Daha sonra nötrofiller PMA veya diğer ajanlar tarafından aktive edilir.
↓
Daha sonra hücreler akış sitometresinde analiz edilir. Fagositlerin floresansındaki bir artış belirlenir.
Akış sitometresi ayrıca, tek tek hücreler tarafından üretilen H202'nin kantitatif olarak belirlenmesine izin verir. Bu nedenle akış sitometrik analizi, NADPH oksidaz fonksiyonundaki kısmi kusurların tespitinde veya XD'ye bağlı CGD'nin X-bağlı formunun heterozigot taşıyıcılarının taranması için faydalıdır.
4. Fagosit degranülasyonu:
Fagositik degranülasyon, lizozom içeriğinin fagozomlarla füzyon haline getirilmesi işlemi olup, lizozomal içeriğin fagolizozom içine deşarjına yol açar. Degranülasyon aktif bir işlemdir ve enerji gerektirir. Nötrofillerin normal metabolik yollarının (özellikle, oksijen tüketimi ve heksoz monofosfat şantı boyunca glukoz meatabolizması) bozulması, degranülasyonu engeller; sonuç olarak, fagositler tarafından hücre içi mikropların öldürülmesi etkilenir.
Bir süspansiyondaki fagositlerin degranülasyonu, çeşitli aktive edici ajanlar ve hücrenin hücre iskeletini etkileyen bileşikler (sitokalasin B gibi) ile indüklenebilir. Fagositler esas olarak ikincil ve üçüncül granülleri serbest bırakmakta ve ELISA yöntemleriyle ölçülmektedir.
ben. Laktoferrin (ikincil bir nötrofil granülü) ikincil granül salımının bir belirteci olarak kullanılır.
ii. Albumin, tersiyer granül salımının bir ölçüsü olarak test edilir.
Fagositlerden primer granül salımı için tahlil, primer granüllerin kapalı alanlara salınması aranarak yapılır. “Sinirli fagositoz”, primer granüllerin salınımını değerlendirmek için kullanılan bir tahlildir (Şekil 27.7).
Isı ile birleştirilmiş immünoglobülin veya immün kompleksleri, bir petrileşmeye sabitlenir.
↓
Nötrofiller, piridinkine ilave edilir ve inkübe edilir. Fc reseptörleri vasıtasıyla, nötrofiller, ısı ile birleştirilmiş immünoglobülin veya immün komplekslerinin Fc bölgelerine bağlanır. Sonuç olarak, nötrofiller, ısıyla birleştirilmiş immünoglobülin veya immün komplekslerini fagositoza sokmaya çalışır. Ancak nötrofiller onları fagositoz yapamazlar (çünkü onlar petri kabına sabitlenmişlerdir). Sonuç olarak, nötrofiller tanecikli içeriklerini üzerlerinden serbest bırakırlar.
↓
Miyeloperoksidaz veya β-glukoronidaz gibi primer granül proteinlerinin salınım hızı, degranülasyonu tahmin etmek için kullanılır. Birincil / ikincil granüllerin sentezindeki eksiklikler ayrıca hücre içi granüllerin etiketli mAb'ler ve akış sitometrisi ile boyanmasıyla da tespit edilebilir.
Nötrofiller Tarafından Bakteriyel Öldürme:
Mikrobisidal analizlerin gerçekleştirilmesi zordur. Genellikle, daha basit deneyler yeterli bilgi sağlamadığında mikrobisidal deneyler yapılır.
Staphylococcus aureus suşu 502A, nötrofillerin mikrobisidal kapasitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır.
Log fazında yetişen Staphylococcus aureus suşu 502A, insan serumları ile inkübe edilir (immünoglobulin ve opsoninler olarak işlev görmesi için tamamlayıcı proteinler sağlamak için).
↓
Taze izole edilmiş nötrofiller, 5-10 bakteri / nötrofil konsantrasyonunda eklenir.
↓
30 dakikalık inkübasyondan sonra, nötrofiller tarafından tutulmayan bakteriler, ilaç gentamisin ilavesiyle öldürülür. (Gentamid, nötrofillere girmez ve fagositozlu bakteriler hayatta kalır.)
↓
Nötrofillerin alikotları, 30 dakikalık aralıklarla çıkarılır ve nötrofilleri lize etmek ve bakterileri serbest bırakmak için steril damıtılmış suyla karıştırılır. Her bir kısımdaki canlı bakteri sayısı, kan agar plakalarının seri seyreltilmesi ve kaplanması ile ölçülür.
↓
Sonuçlar bir grafik üzerinde çizilmiştir.
ben. Normal nötrofiller, bir saatlik inkübasyonun ardından canlı hücre içi bakterilerde iki log azalması gösterir.
ii. Neredeyse homozigot CCD hastalarından nötrofiller tarafından öldürme yoktur.
iii. Heterozigot CGD taşıyıcılardan gelen nötrofiller, nötrofillerin kısmi öldürdüğünü gösterir.
