Hücrelerdeki Antijenlerin Tespiti için Kullanılan İmmünofloresan
İmmünofloresan hücrelerde antijen tespiti için kullanılır!
Dokulardaki antijenleri tespit etmek için immünokimyasal olarak floresan bileşikleri Coons (1941) tarafından tanıtılmıştır.
İmmünofloresan, hücrelerdeki veya dokulardaki antijenlerin (bilinen antikorları kullanarak) ve ayrıca serumdaki antikorların (bilinen antijenleri kullanarak) saptanmasında kullanılır. Floresans, madde başka bir renkteki ışığa maruz kaldığında bir renkteki ışığın yayılmasıdır. Bir flüoresan madde belirli bir dalga boyunda bir ışıkla uyarıldığında, ışığı emer ve başka bir dalga boyunda bir ışık yayar.
ben. Floresan izotiyosiyanat (FITC) 490-495 nm'de maksimum ışık absorbansına sahiptir ve 530 nm'de (yeşil renk) ışığı yayar.
ii. Tetrametil rodamin izotiyosiyanat, 550 nm'de maksimum ışık absorbansına sahiptir ve kırmızı renkli ışık (580 nm) yayar.
a. Doğrudan immünofloresan:
Bu teknik, hücrelerde veya dokulardaki antijenleri tespit etmek için kullanılır.
Bilinmeyen antijeni olan doku bir cam slayta sabitlenir.
↓
FIT'ye konjuge (konjugat olarak bilinir) bilinen antiserum (ilgilenilen antijene spesifik) doku üzerine yerleştirilir ve inkübe edilir.
ben. İlgilenilen antijen dokularda ise konjugat antijene bağlanır.
↓
Ardından, bağlanmayan konjugatı çıkarmak için slayt yıkanır.
↓
Slayt daha sonra floresan mikroskobu altında izlenir.
ben. Dokuda antijen varsa parlak yeşil renk görülür.
ii. Dokuda antijen yoksa, tüm konjugat yıkama aşaması sırasında yıkanır ve sonuç olarak yeşil renk olmaz.
Bu teknik ayrıca enfekte olmuş dokulardaki bakteri veya viral antijenlerin varlığını tespit etmek için kullanılır.
b. Dolaylı İmmünofloresan:
Bu teknik serumdaki antikorları tespit etmek için kullanılır.
Bilinen antijenleri içeren hücreler, cam kaymaya sabitlenir.
↓
Test serumu lamın üzerine eklenir ve inkübe edilir.
ben. Serumda antikorlar (hücrelerdeki antijenlere karşı) varsa, antikorlar hücrelerdeki antijenlere bağlanır.
↓
Ardından, bağlanmayan serum bileşenlerini çıkarmak için slayt yıkanır.
↓
FITC'ye konjuge anti-insan immünoglobulin eklenir ve inkübe edilir.
ben. FITC konjuge anti-insan immünoglobulini, hücre antijenlerine bağlı serum antikorlarına bağlanır.
↓
Yıkandıktan sonra, slayt floresan mikroskobu altında izlenir.
ben. Parlak yeşil rengin varlığı, serumun hücrelerdeki antijenlere karşı antikorlara sahip olduğunu gösterir.
ii. Yeşil rengin yokluğu, kullanılan hücrelerde antijenlere karşı serum antikorlarının olmadığını gösterir.
